肺炎嗜衣原体抗原和血清学检测的研究

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1、复旦大学硕士学位论文摘要肺炎嗜衣原体(Chlamydophila，C．pneumoniae，缩写Cpn)是一种常见的呼吸道病原体，所致疾病最常见的是肺炎和支气管炎，近年来诸多研究表明其与动脉粥样硬化综合症，哮喘等疾病有关【¨。由于Cpn为严格胞内寄生性，分离培养较为困难，从而影响深入研究Cpn的致病机制、特异性诊断和疫苗的开发。本文应用进口Cpn菌株，通过建立Cpn感染细胞技术，获取大量Cpn抗原，制备斑点抗原片，用于微量免疫荧光染色(Micro．immunofluorescence，MIF)检测血清抗体。同时根据Cpn主要外膜蛋白(Majorout

2、ermembraneprotein，MOMP)核苷酸序列，构建MOMP／pQE31重组质粒，制备MOMP重组抗原，用于ELISA检测诊断Cpn感染。通过对以上检测结果的分析，较为客观的评定每种方法的血清抗体特异性和敏感性，以便用于辅助Cpn感染的临床诊断，探寻Cpn感染与疾病的因果关系。论文第一部分应用进口Cpn菌株，感染Hep．2细胞，分别以瑞氏．姬母萨染色、吖啶橙(AcridineOrange，AO)染色和直接免疫荧光(DirectImmunofluoresc圮ncg，DIF)染色三种方法鉴定Cpn感染细胞。Cpn感染Hep．2细胞的最适条件是用

3、含lug／ml放线菌酮的维持液，在35℃5％C02孵箱中培养7天，并在培养的第0，3，4，5天作2600rpm／min离心lh，感染成功率极高。染色反应显示，瑞氏．姬母萨染色可将Cpn包涵体染成蓝紫色或红紫色；吖啶橙染色则显示Cpn感染的Hep．2细胞呈现鲜明的橘红色；免疫荧光抗体染色后，在Cpn感染细胞内可见亮苹果绿色包涵体。论文第二部分是将Cpn抗原用于制备斑点抗原片。通过建立MIF检测血清抗体，诊断Cpn感染。用Cpn抗原片和夕卜周血单核细胞(PeripheralBloodMononudoarCell，PBMC)抗原片分别检测100份病人血液标

4、本。结果显示：用Cpn抗原片检测血清IgG抗体，阳性率为61％；用PBMC抗原片检测，阳性率60％。经统计，两者阳性检出率无明显差异。用Cpn感染细胞制作的Cpn斑点抗原片可用于临床检测血清Cpn．IgG抗体，且具有特异性、敏感性高的特点。论文第三部分通过构建和表达CpnMOMP重组抗原，应用包涵体纯化法纯化重组抗原后建立ELISA试验，并检测了82份正常人血清及临床标本207份，其中心血管疾病血清118份，呼吸系统疾病血清59份，其他疾病30份。用重组抗原检测血清IgO，正常人血清阳性检出率仅为3．7％；而207份病人血清，116份为阳性，总阳性率

5、56．0％。其中心血管疾病血清118份，阳性69份，阳性率58．5％；呼吸系统疾病血清59份，阳性38份，阳性率64．4％；其他疾病患者30份，阳性9份，阳性率仅30．O％。与进口ELISA试剂盒及Cpn全抗原相比，阳性率基本相符，统计分析无显著意义，但重组MOMP蛋白的抗原特异性较高，3复‘日J大学硕士学位论文且具有抗原制备较为方便和价廉等特点。本课题通过细胞培养技术制备获得大量Cpn，经瑞氏．姬母萨染色、吖啶橙染色、免疫荧光抗体染色鉴定证实为Cpn抗原。将纯化的Cpn抗原制成抗原片，通过Cpn抗原片与PBMC抗原片检测血清抗体的比较，经统计显示阳

6、性检出率无明显差异。表明Cpn抗原片检测法具有较好的敏感性和特异性，可用于临床辅助诊断。制备重组MOMP抗原用于ELISA检测血清抗体，结果显示正常人及病人血清抗体效价有明显差异，且与进口试剂盒及全抗原检测阳性率基本相符。以重组蛋白MOMP为基础建立的ELISA方法灵敏度和特异性高，可用于Cpn感染的诊断和所致疾病的研究，具有重要的临床意义和学术价值。关键词：肺炎嗜衣原体，Cpn抗原片，微量免疫荧光法，ELISA，主要外膜蛋白中图分类号：R374+．34复旦大学硕士学位论文ABSTRACTChlamydophilapneumoniae(Cpn)，wh

7、ichbelongstothechlamydiae,isallimportantrespiratorytractpathogenicmicroorganism．ThemostcommondeseasescausedbyCpnarepneumoniaeandbronchitis，recentresearchesalsoindicateditsrelationshipwithartherosclerosisdesease，bronchialasthma,sarcoidosisandasthma．Cpnisprovedtobedifficulttoisol

8、ateandculture，whichlimitedcarryingoutfurtherstudyabout