人源饲养层对人胚胎干细胞支持情况的研究

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1、中山大学硕

2、上学位论文人源饲养层对人胚胎干细胞支持情况的研究专业：干细胞组织工程硕士研究生：刘彩霞导师：周灿权教授摘要1998年Thomson首次报道从人的囊胚中获得发育全能的人胚胎干细胞，引起了世界各国的热切关注。建立核移植来源的胚胎干细胞系，进行治疗性克隆更是当代生命科学研究的焦点!胚胎干细胞在发育生物学、细胞治疗、组织替代等医学领域有着广阔的研究前景，同时也为基因功能研究、药物筛选和新药开发提供了良好的工具。胚胎干细胞来自囊胚的内细胞团，能在体外长期培养而保持未分化状态及发育全能性。传统上，需要鼠胚胎成纤维细胞作饲养层，才能维持其未分化状态。这可能将

3、鼠类病毒传染给患者。干细胞治疗人类疾病时，必须要求无动物源性培养，以避免鼠源性病毒可能带来的危害。为减少外源性动物成份，本研究选用包皮、子宫内膜、绒毛、输卵管、胎儿皮肤、肌肉，HAF(人乳腺永生细胞，昆明动物研究所赠送)7种不同的胎儿、小儿及成人组织作饲养层，比较了它们对人胚胎干细胞的支持情况；并在来源于包皮的饲养层上成功地建立了一株新的人胚胎干细胞系。建系内细胞团来自知情同意的体外受精病人废弃的胚胎，包皮来自d,Jg#b科包皮环切术。在无血清培养条件下，这株新系已传到27代，核型正常(46XX)J]．保持全部胚胎干细胞的生物学特征：多能性、高度自我更新能

4、力及未分化状态，高度表达碱性磷酸酶活性，表达常用于人胚胎干细胞鉴定的分子标记：oct．4，SSEA．3，SSEA．4，TRA．1．60，1rI认．1-81等。tllIIj人学硕上学位论文第1部分饲养层细胞培养【目的】1．原代培养包皮真皮、子宫内膜基质、绒毛、输卵管、胎儿真皮、胎儿肌肉及胎鼠成纤维细胞。2．传代及大量冻存上述细胞以备接种人胚胎干细胞。3．比较不同组织学来源的细胞生物学特征。【方法】1．无菌条件下取胎鼠及病人术后废弃的包皮、子宫内膜、绒毛、输卵管、胎儿皮肤、胎，L肌肉。2．剪碎所需培养的组织，用胰酶或胶原酶消化成单细胞。3．细胞长满后用O．25

5、％胰酶．0．04％EDTA消化，1：3~4传代。4．液氮罐口悬挂方法冷冻大量传代细胞。【结果】1．建立了10株包皮细胞系。2．建立了子宫内膜、胎儿皮肤、胎儿肌肉细胞系各2株。3．培养了输卵管、流产胎儿的绒毛、胎鼠成纤维细胞系各一株。4．冻存了大量传代细胞以备接种胚胎干细胞。第2部分各种饲养层对人胚胎干细胞生长支持情况的比较【目的】1．摸索适合人胚胎干细胞生长的不同饲养层条件。2．比较人胚胎干细胞在不同饲养层上的生长情况。3．检测不同饲养层细胞分泌的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。【方法】1．从丝裂霉素作用时间、细胞密度等方面，寻找不同饲养层适合人胚胎干

6、细胞生长的最佳状态。2．在各种饲养层上同期接种同一株入胚胎干细胞，比较它们的生长特点。中山大学硕士学位论文3．ELISA方法检测各种人源饲养层细胞分泌的bFGF。【结果】1．所试用各种饲养层在一定程度上均可支持人胚胎干细胞生长，传代超过10代，以包皮和输卵管来源的饲养层为最佳。2．根据细胞生长特性，饲养层从优到劣依次为：包皮、子宫内膜、绒毛、输卵管、胎皮、胎肌；根据胚胎干细胞生长形态，饲养层排序为：包皮、输卵管、子宫内膜、绒毛、胎肌、胎皮。3．SPSS统计分析：输卵管细胞分泌的bFGF与其它组间有统计学意义(p

7、O．05)与子宫内膜、胎皮有差异(PO．05)。第3部分包皮饲养层上人胚胎干细胞的建系和鉴定【目的】1．在包皮来源的饲养层上建立人胚胎干细胞系。2．鉴定新建的细胞系是否符合胚胎干细胞的建系标准。【方法】1．收集不适合移植和冷冻的废弃胚胎，培养到囊胚阶段。2．机械法分离内细胞团，接种到包皮饲养层上。7天内首次传代，以后每4~6天传代一次。3．鉴定新建立的人胚胎干细胞系。3．1分析核型并检测碱性磷酸酶活性。3．2用免疫荧光方法检测下列分子标记：SSEA一1，SSEA-3，SSEA一4，TRA一1—60，TRA-1．81

8、和CD9，CD90。3．3利用RT．PCR检测未分化细胞Oct-4及分化细胞三胚层相关基因的表达。3．4将来分化细胞注射入免疫缺陷的SCID小鼠后腿肌肉，观察是否形成畸胎瘤，检测胚胎干细胞的体内分化潜能。【结果】中lII大学硕士学位论文1．在包皮来源的饲养层上建立了一株人胚胎干细胞系。2．核型正常，为46XX．；碱性磷酸酶活性较强。3．细胞表面抗原SSEA．3、SSEA．4和肿瘤相关抗原TRA-1．60、TRA．1_81阳性；SSEA-l、CD9、CD90阴性。4．未分化细胞表达Oct．4，分化细胞表达三胚层基因GAPDH，NF．68(外胚层)；a-Car

9、diacactin，13．actin(中胚层)；十feto、Glu