人内皮抑素基因转染治疗肝细胞性肝癌的实验研究

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1、浙江人学博士学位论文人内皮抑素基因转染治疗肝细胞性肝癌的实验研究浙江大学医学院普通外科学博士研究生：刘宏导师：彭承宏教授中文摘要肝细胞性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在我国，因恶性肿瘤死亡者中肝癌患者列第二位。外科手术是目前治疗肝癌最有效的方法，但是仅有少部分患者有机会进行肿瘤的手术切除。研究发现肝移植对早期肝癌患者疗效显著，可因肝癌进行移植手术的病例却非常少。因为其它方法都属于姑息治疗，大量的肝癌患者得不到有效治疗，急需新的治疗方法。研究证实，肿瘤的生长依赖于血液供应，抑制肿瘤血管生成可以使肿瘤缺血，甚至萎缩，因此肿瘤的血管系

2、统已成为肿瘤治疗的重要目标。传统的放、化疗以肿瘤细胞为靶细胞，很容易产生抗性，而抗血管生成治疗以内皮细胞为目标，内皮细胞遗传性状稳定，不会对血管生成抑制剂产生耐药。目前已经发现了多种抑制血管生成的物质，0’Reilly等发现的内皮抑素就是其中一种。内皮抑素是一种分子量为22kO的蛋白质，能够特异性的抑制血管生成，它最初从鼠血管内皮瘤细胞系的培养基中分离得到，是胶原XⅧ羟基端的一个片段。在体外试验中内皮抑素可以抑制内皮细胞的增殖，其作用机制目前尚不完全清楚，可能是通过内皮细胞生长因子(VEGF)和纤维细胞生长因子(FGF一2)途径抑制血管

3、生成。另外，有研究发现内皮抑素能够诱导血管内皮细胞凋亡，抑制金属基质酶，并通过调节c-myc水平抑制内皮细胞的迁移。动物实验证实重组内皮抑素蛋白可显著抑制包括肝癌在内的多种移檀瘤的生长。有生物活性的重组内皮抑素生物性质不稳定，制备非常困难。而肿瘤的抗血管生成治疗要求长期使用大剂量的重组内皮抑素蛋白，使患者的经济负担非常重，此外重复用药也带来了许多不便。～种替代性方法就是将外源性内皮抑素基因转浙江大学博L学位论文入宿主细胞，在肿瘤周围产生有活性的内皮抑素，达到治疗肿瘤的目的。有研究表明利用病毒载体进行抗血管生成治疗能有效抑制鼠移植瘤模型的

4、生长。腺相关病毒是其中最重要的一种载体，因为它具如卜特点：没有致病性；不会引起免疫反应；转染效率高；能够转染未分化细胞；宿主细胞范围广：能将目的基因定位整合入宿主细胞染色体，并长期、稳定表达。有研究发现腺相关病毒皮下注射后可以在肝细胞中集聚，提示它具有嗜肝性。在本研究中我们构建了含人内皮抑素基因的重组腺相关病毒载体，探讨腺相关病毒介导的内皮抑素基因转染对肝细胞性肝癌的抑制作用，实验共分三个部分第一部分：人内皮抑素基因克隆和重组腺相关病毒构建根据genebank中的人内皮抑素序列设计引物，在上游引物中插入EcoRI酶切位点，在下游引物中插

5、入SalI酶切位点，运用RT-PCR方法从新鲜人肝组织中扩增内皮抑素基因(hEN)，克隆到pUCl9载体上，进行酶切鉴定和全自动正反向测序。用限制性内切酶EcoRI和SalI消化腺相关病毒质粒pSNAV，将其与hEN连接，构建含目的基因的2型重组腺相关病毒质粒pSNAV—hEN，pSNAV—hEN的病毒包装由中国预防科学院病毒研究所协助完成，产物被命名为rAAV2一hEN，病毒滴度为1×10“v．g／ml，为了检测腺相关病毒的转染效率，同时合成含报告基因的重组腺相关病毒rAAV2一EGFP—hEN。第二部分：重组腺相关病毒体外转染肝癌细

6、胞的实验研究rAAV2一EGFP—hEN转染人肝癌细胞系Hep3B，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白，流式细胞仪检测显示当多重感染剂量(MOI)值为1×106v．g／cell时，表达绿色荧光蛋白的细胞数达到峰值，约为62．48％。将rAAV2一hEN按最适MOI转染肝癌细胞，RT—PCR结果证实转染细胞在mRNA水平高表达内皮抑素；另外，转染细胞浓缩上清的SDS—PAGE电泳中也检测到了约22KD的特异性蛋白条带，提示腺相关病毒可介导内皮抑素基因高效转染肝癌细胞，并表达内皮抑素蛋白。通过MTT法检测内皮抑素对内皮细胞增殖的抑制作用，用转染细

7、胞的培养液上清处理人脐静脉内皮细胞(ECV304)24h、48h、72h，检测发现内皮抑素转染组的光密度值明显低于空病毒组和空白对照组(p<33．05)，而空病毒组和空白对照组之间无显著差异，提示转染细胞分泌的内皮抑素抑制了ECV304细胞的增殖。流式细胞分析显示转染细胞培养液上清处理72h的内皮细胞有18．43％发生凋亡，浙江大学博上学位论文明显高于空病毒转染组(3．62％)和空白对照组(O．89％)。第三部分：内皮抑素基因转染对人肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用在裸鼠背部皮下注射2x106Hep3B细胞建立肝癌移植瘤模型，4周后将荷瘤裸鼠随

8、机分为三组，每组6只，分别瘤内注射rAAV2一hEN，AAV2或生理盐水。每5天测量一次肿瘤的长径和短径，计算其体积，结果显示内皮抑素处理组和对照组相比移植瘤的生长被明显抑制。30天后收集裸鼠血清标本，经E