重组小鼠血管抑素基因转染抗血管生成治疗胆囊癌的实验研究论文

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1、重组小鼠血管抑素基因转染抗血管生成治疗胆囊癌的实验研究论文张吉成，陈燕凌，张德新，陈宏明，杨定忠，王作仁【关键词】胆囊肿瘤；血管抑素；抗血管生成；基因转染Experimentalstudyofantiangiogenictherapyouseangiostatingenetransductioningallbladdercancer【Abstract】AIM:Toinvestigatetheexpressionofmouseangiostatingenetransfectedintogallbladd

2、ercancercells,antiangiogenicactivityofangiostatinproteinandinhibitoryeffectofangiostatinonimplantedgallbladdercarcinomaofnudemice.METHODS:TherebinantvectorpcDNA3.1(+)angiostatinelipofectamine2000.AngiostatinproteinexpressioninedbyVD)ofeachgroupacroscopi

3、cresistantcellclonesed.VDoftheangiostatingroupayhavepotentialvalueinthetreatmentofgallbladdercancerinthefuture.【Keys;angiostatin;antiangiogenesis;genetransfection【摘要】目的：研究重组小鼠血管抑素基因真核表达质粒转染的胆囊癌细胞表达具有抑制血管内皮细胞生长活性的血管抑素蛋白，以及对裸鼠种植性胆囊癌生长的抑制作用.方法：应用脂质体lipofec

4、tamine2000将重组小鼠血管抑素基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)angiostatin转染胆囊癌细胞株GBCSD，G418抗性筛选；以EM培养基:Gibco公司.λdsDNA/HindⅢ标准物和各种限制性核酸内切酶:华美公司或NeL/L小牛血清、高糖DMEM培养液中，37℃，50mL/LCO2条件下培养.血管内皮细胞系ECV304:第四军医大学口腔医院，在含100mL/L胎牛血清、高糖DMEM培养液中，37℃,50mL/LCO2条件下培养.1.2方法1.2.1pcDNA3.1(+)ang

5、iostatin质粒构建和基因转染经酶切、回收和连接将血管抑素angiostatincDNA基因片断装入真核表达载体pcDNA3.1(+),转化、挑选抗性克隆和提纯质粒，经酶切鉴定和基因测序证实.连续培养胆囊癌细胞株GBCSD，脂质体lipofectamine2000基因转染，设置实验组（血管抑素组）pcDNA3.1(+)angiostatin1.2μg/脂质体3μL,阴性对照组（空载体对照组）pcDNA3.1(+)1.2μg/脂质体3μL,空白对照组脂质体3μL.转染48h后换用含筛选浓度新霉素G4

6、18(400mg/L)的选择培养液培养.1g/LG418培养液扩大培养.另取野生GBCSD细胞为对照,.freelL/L小牛血清、高糖DMEM培养液培养，取对数生长期的细胞1×104接种于24孔培养板中,每日计数3孔中的细胞数绘制生长曲线.1.2.2血管抑素的表达及生物学活性用EM)调细胞密度为1.0×108/L,接种于24孔板,每孔接种0.5mL,于37℃,50mL/LCO2条件下培养24h,换用含1μg/LbFGF的新鲜培养液,并加入含血管抑素的培养液上清继续培养24h,进行MTT比色法检测,于5

7、70nm处测其A值.对照组为空白载体转染的GBCSD胆囊癌细胞的培养液上清.1.2.3裸鼠肿瘤生长体积测定将Balb/c裸鼠（鼠龄4~6L，血管抑素组6只，野生GBCSD细胞对照组5只，分别注射GBCSD/pcDNA3.1(+)angiostatin细胞和GBCSD细胞；观察30d后处死荷瘤裸鼠，切取肿瘤并测量其长径a和短径b（单位mm），按公式1/2×ab2计算肿瘤的体积.1.2.4肿瘤微血管密度（MVD）免疫组化将以上2组肿瘤标本制备成石腊切片，按SABC法进行免疫组化染色，一抗为兔抗鼠vVD值，

8、计算出同组裸鼠肿瘤的平均MVD值.统计学处理：用SSPS12.0进行数据处理，t检验.P0.05即认为有统计学差异.2结果2.1pcDNA3.1(+)angiostatin质粒构建和基因转染鼠源性血管抑素cDNA基因片段包括鼠纤溶酶原N端分泌信号肽(SS)、激活前肽(PA)、Kringle14(K14)和融合的流感病毒血凝素抗原标记肽(HAtag).酶切鉴定电泳结果显示XbaⅠ+HindⅢ双酶切和BamHⅠ单酶切载体pcDNA3.1(+)angiosta