prrs山东分离株orf7基因的原核表达与rt-pcr快速检测

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1、AAaaaminoacidAmpCPEDEPCAmpicillin缩略语及符号c”opamogenice腩ctdiethylpyrocarbonatedithiotllreitol氨基酸氨苄青霉素致细胞病变效应乙基焦碳酸酯■硫苏糖醇ELIsAenzyme1inkedimmunosorbemassay酶联免疫吸附试验HRPhorseradishperoxidase辣根过氧化物酶IPTGisoproply-B·D·thiogalacloside异丙基硫代半乳糖=凸=LBLau—abrothk订odaltonLB培养基干道尔顿OPDo巾henylenediaminedihydroc

2、hlorde邻苯二胺ORF卵enreading仔ame开放阅读框架PAGEpolyacryIamidegeleIectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳SDSTEMEDrotatlonDermmute转，分sodiumdodecylsulfate十一：炕基磺酸钠NNNNl一tetramethylaminomethaneNNNNi四甲基氨基甲烷Y903833关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山

3、东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导师签名；些叁固窭，日期：垫《厶．[。山东农业大学硕士学位论文中文摘要1．猪繁殖与呼吸综合征病毒山东分离株0RF7基因的克隆、鉴定及原核表达猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSv)引起的母猪繁殖障碍和仔猪呼吸困难为特征的一种新的病毒性传染病。N蛋白

4、抗原表位是PRRSV抗原分型的主要依据，也是血清型鉴别诊断的抗原基础。本研究在以下两个试验表达了美洲型特异的N蛋白抗原表位基因，旨在为山东PRRS的鉴别诊断方法的建立奠定抗原基础。本研究通过从山东某猪场患败血症仔猪的肺脏、淋巴组织中分离到1株PRRSV，流行特征表现为仔猪出现严重的呼吸道症状，该病毒能在Marc-145细胞上生长，但不能在Vero、BHK21、PKl5等细胞上增殖，分离毒适应Marc一145细胞后，产生以皱缩、脱落、崩解为特征的细胞病变，分离毒在Marc．145细胞第四代为107TCID50／m1，初步将分离毒鉴定为PRRsVsD一1株。然后根据PRRSVVR

5、一2332株的基因序列，设计能够扩增美洲型的N蛋白抗原表位基因的一对含有BamHI和EcoRJ双酶切位点的引物，经RT_PcR技术从提取的sD．1株病毒RNA中扩增出大小为366bD的N基因，并将其成功的克隆进pMD．18T载体，筛选出了含有ORF7基因的重组质粒，从而为进一步的表达奠定了基础。测序显示PRRSvSDl株ORF7基因的序列与PRRSVVR2332株基因序列完全一致，符合率达99％以上，与欧洲株的同源性不到60％。说明目前山东省流行株为美洲型，为预防该病在山东的流行提供理论依据。通过PcR方法从阳性重组质粒pMD一18T．N扩增ORF7基因，将此基因克隆到原核高

6、效表达载体pGEx．6P—l中，构建了重组质粒pGEx一6P．1一N。将该重组质粒转化入宿主菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达后SDS—PAGE分析表明在34kD处出现了目的条带。确立了最佳诱导表达条件(IPTGlmM、作用时间4h)，目的蛋白利用Amersh锄的GST纯化试剂盒对表达产物进行过柱纯化，最终获得了高浓度的重组N蛋白。经westem-Blot免疫印迹分析，该表达产物与美洲型PRRSv血清发生反应，说明N蛋白抗原表位基因获得了高效表达。2．用一步法RT_PCR技术快速检测PRRsV方法的研究PRRs山东分离株ORF7基凶的原核表达与R1二PcR快速检测本研究

7、成功地建立了检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PI氓sV)的RT-PcR技术。根据PRRsv己发表的核苷酸序列，在其N基因保守区设计了一对跨幅约400bp的特异性引物N1肘2，对已知PRRSVSD-l毒株和PRRs临床病料进行ImPCR扩增，结果扩增出366bp的特异片段，而利用合成的引物以相同的反应条件对猪细小病毒、伪狂犬病病毒、乙型脑炎病毒均未扩增出片段。证实建立的RT-PcR的特异性。用此方法检测30份疑似PRRs病例组织病料，结果12份为阳性。结果表明，该研究建立的从临床组织病料直接提取细胞总RNA进