耐热木聚糖酶在重组菌1020中培养优化及其的应用的研究

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1、摘要木聚糖酶是一类重要的木糖苷键水解酶，对水解植物纤维原料中的半纤维素有着重要作用。木聚糖酶用途广阔，目前已在造纸、食品和饲料等工业中得到了广泛应用。尤其是具有耐热耐碱特性的木聚糖酶在造纸等工业领域具有很大的应用潜力，也是目前研究的热点问题。本论文以重组菌1020作为出发菌株，对该菌发酵产木聚糖酶的培养条件进行了系统的研究；考察了木聚糖酶全细胞酶液的酶学性质；并对该酶在木寡糖的制备、KP竹浆的预漂白处理两方面的应用进行研究。木聚糖酶在重组菌1020中以pET28a(+)为表达载体诱导型表达。表达优化结果表明：在以IPTG

2、为诱导剂时，木聚糖酶活力最高为1266.91U/mL；而以29.2mmol/L乳糖为诱导剂，酶活力可达2690.6U/mL，为IPTG的2.12倍，而成本只有IPTG的1/204。因此，乳糖可成功代替昂贵的IPTG作为诱导剂，具有很大的工业应用潜力。采用单因素、Plackett-Burman实验、中心组合设计和响应曲面分析，对重组菌1020发酵产酶的发酵培养基进行优化，得到的最佳培养基配方为（g/L）：蛋白胨15.9、甘油10、(NH4)2SO48、MgSO40.5、MnSO40.025、NaCl5.75、NiCl2·6

3、H2O0.11、ZnSO4·7H2O0.005、CuSO4·5H2O0.01、H3BO30.03、Na2MoO4·2H2O0.05，2+pH7.0。其中蛋白胨、NaCl和Ni浓度对发酵产酶影响显著。在此优化发酵培养基中以乳糖为诱导剂，木聚糖酶活力最高可达4522.09U/mL，是基础发酵培养基的1.68倍。对木聚糖酶粗酶液的性质进行了研究，结果表明该酶的最适pH为8.6，90℃下保温1h后，pH6.5～9.0范围内酶活力可保持50%以上，在碱性范围内表现出很高的pH稳定性；该酶可耐受高温且具有较高的热稳定性，全细胞酶液在

4、60～100℃酶活力随温度的升高而不断升高，70℃保温3h，酶活力变化不显著，90℃保温3h后，酶活仍残留约50%。这种耐碱耐高温的特性符合造纸等工业的应用要求。在此酶学性质的基础上进行后续的应用研究。以甘蔗渣为原料，碱抽提法制备甘蔗渣木聚糖。最佳工艺条件为：NaOH浓I度为8.0%，110℃下抽提1.5h，该条件下木聚糖的提取率可达到24.56%。将该酶分别作用于可溶性Sigma燕麦木聚糖和自制的蔗渣木聚糖，研究酶解条件对酶解效果的影响。酶解可溶性Sigma燕麦木聚糖，底物浓度为3.0%、酶用量为100.0U/g木聚糖

5、、75℃酶解1.0h，木寡糖DP值为2.68，酶解产物主要为木二糖和木三糖；酶解可溶性自制蔗渣木聚糖，底物浓度2.0%、酶用量100.0U/g木聚糖、95℃下酶解3h，木寡糖DP值为2.94，均可满足制备功能性木寡糖对聚合度的要求。由于不同来源的木聚糖结构不尽相同，影响酶与底物的作用效果，因而酶解条件有所差异。最后，以KP竹浆为原料，初步研究该耐热耐碱木聚糖酶对浆料预漂白的作用。结果显示浆料经酶助漂预处理后，再经常规处理，最终漂白浆白度从原浆的38.70%ISO提高到60.32%ISO，比未经酶预处理的漂白浆白度提高了近

6、7.3%ISO，预漂效果显著。关键词：木聚糖酶培养优化木寡糖制备助漂应用IIABSTRACTXylanaseisanimportantenzymeofgloc-hydrolases,whichcanhydrolyzethehemicellulosesofplantwall.Itiswidelyusedinpaperindustry,food,andanimalfeedindustries.Especiallythethermostablexylanasewithalkalitoleranceisofparticulari

7、nterest.StudyonthecultivatingconditionandculturemediumofrecombinatntE.coli1020stainwereperformedinthisdissertation,includingtheinvestigationoftheenzymaticpropertyofcrudexylanase.Xylanasewasusedinpreparationofxylooligosaccharideandpre-bleachingofKPbamboopulp.Resul

8、tsofstudyoninducingreagentoflactosewasbetterthanIPTGasinducerinthebasicculturemediumofrecombinantE.coli1020.WhenIPTGwasusedastheinducer,themaximumactivityofxyl