拟南芥ros1突变抑制因子筛选、基因克隆及其功能的分析

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1、摘要外源基因插入到植物基冈组中会引起本身或相关的内源基因发生转录水平的基因沉默。这种转录水平的基因沉默的过程通常是由外源基闪产生siRNA，再由这些siRNA介导DNA甲基化及组蛋自修饰变化等来实现。拟南芥中现已发现，很多RNAi过程中的组件、DNA甲基转移酶以及组蛋白甲基转移酶等参与到这一过挥中。拟南芥中编码DNA糖基化酶的ROSl基因突变后能够使多拷贝的转基因PrOp,D29A：￡LE和内源RD29A基因的启动子区发生超甲基化，从而使内源RD29A基因及外源￡￡，c转基因表现出转录水平的基因沉默现象，而与其相邻的转基因

2、Proj5S：NPTll的启动子区的甲基化虽没有发生变化但却同样表现出转录水平的基冈沉默。ROSI基因作为一种DNA去甲基化酶参与抑制转录基因沉默过程中。利j={{jrosl突变体中沉默的Pr03jsjNPz噼}基因作为筛选标记，我们从EMS诱变的rosl后代中筛选到了一系YOrost突变的抑制因子，其中ror](suppressorofrosl)突变体包括两个等位突变，rorl一』}Hrorl．2。RORl基因的突变能够使rosl突变背景中处丁沉默状态的Proj珂ⅣPH，基因恢复表达，但是对PrORO?¨jLUC基因的沉

3、默状态却没有影响。基冈组亚硫酸氢盐测序及拟南芥基因组SouthemBlot分析结果显示突变体中RD29A启动子区整体甲基化情况不受rorl突变的影响，并且基冈组中rDNA区和着丝粒区的DNA甲基化也不受rorl突变的影响。另外，NorthernBlot分析发现rorlrosl突变体中内源转座子T研的表达量却比rosl突变体和C24野生型(rosl突变体的背景)都高。通过对转基因Proj5S：NPTII的启动子区的甲基化及组蛋闩修饰的分析显示，虽然C24野生型，rosl突变体及roslrorl)f)【突变体中转基因Pr03Ⅱ

4、jNP弛珀勺3船启动子区甲基化情况没有变化，但是相对于roM突变体，rorlrosI突变体中该区域组蛋白H3．K9的二甲基化程度降低了，而组蛋白H3的乙酰化程度则升高了。这说明rorl突变引起的转基冈PmJ镕j．ⅣPm区域基因沉默的释放与DNA甲基化变化无关而与组蛋白的修饰状态的变化有关。另外，rorlrosl突变体表现出明显的发育上的异常表型，如植株矮小、早花等，一些突变体在发育晚期还出现末端花结构异常的表型。基因定位的结果显示尺。尺』基因编码一个拟南芥DNA复制蛋(：tA2(RPA2A，At2924490)。RORl／

5、RPA2A基因在根失及茎尖的分生组织表达量较高。RORl／RPA2A基因突变会影响根尖及茎尖顶端分生组织细胞的分裂，但是对细胞最终的大小没有影响。亚细胞定位结果显示，RoRl，RPA2A蛋白定位于细胞核内，该基因突变后突变体植株对DNA烷化剂甲基甲磺酸(MMS)超敏感，说明RORI／RPA2A基因在DNA修复过程中起重要作用。由丁二ROSl蛋白也具有DNA修复的活性，并且酵母般杂交体外实验证明了RORl／RPA2A蛋白与ROSl蛋向的互作关系，我们推测RoRl／RPA2A蛋白的DNA修复功能很可能与ROSl蛋白相关，而其在

6、基因沉默方面的调节功能则具有相对独立性。我们的研究揭示了拟南芥DNA复制蛋白A2在维持特殊区域的组蛋向修饰模式和转录水平的基因沉默过程中以及在拟南芥顶端分生组织发育过程中的重要作用。关键词：DNA甲基化，组蛋白修饰，rosl突变体，rorlrosl突变体，RORl／RPA2A基因，ROSl基因AbstractTheforeigngenesintegratedintoplantgenomesandtheirendogenoushomologousgenesoftenbecomesilencedatthetranscripti

7、onallevel．ThiskindoftranscriptionalgenesilencingisusuallytriggeredbysiRNAsderivedfromtheforeigngenes．RNA-directedDNAmethylationandhistonemodificationareinvolvedinthisprocess．ManylinesofevidencesuggestthatsomeenzymesasRNAprocessingfactors，DNAmethyltransferasesandhi

8、stonemethyltransferasesareinvolvedintranscriptionalganesilencing．MutationsinaDNAglycosylase／lyasegeneROSlcausetranscriptionalgenesilencingofthePrORD29A．