重组腺相关病毒载体介导的人类缺氧诱导因子1α抑制aβ神经毒性作用的实验的研究

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1、中文摘要重组腺相关病毒载体介导的人类缺氧诱导因子一1Q抑制A13神经毒性作用的实验研究摘要基因治疗是二十世纪八十年代以后发展起来的一种疾病治疗模式，其定义是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高新技术。近年来，随着基因治疗技术日趋成熟，基因治疗范围已从遗传病扩展到非遗传病领域，例如肿瘤，传染病，免疫缺陷病，神经系统疾病等，尤其阿尔茨海默病(Alzheimer’Sdisease，AD)的基因治疗目前倍受学者关注，并且己获得初步成效。

2、其中选择适当的病毒载体将具有治疗价值的基因导入神经细胞并使其有效表达是AD基因治疗研究的关键所在。腺相关病毒(adeno．associatedvirus，AAV)，也称腺伴随病毒，属于微小病毒科依赖病毒属，是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒。重组腺相关病毒(recombinantadeno．associatedvirus，rAAV)载体源于非致病的野生型腺相关病毒，安全性好，对人体无致病性，宿主范围广泛，免疫原性小，可通过将外源基因整合到宿主细胞染色体和／或转变成稳定的染色体外附加体形式介导外源基因的长

3、期表达，是基因治疗研究中应用最为广泛的载体系统之一。缺氧诱导因子．1d(hypoxiainduciblefactor．1Q，HIF．1Q)是一种在缺氧应答过程中起重要作用的核转录因子，广泛参与缺氧诱导的细胞适应性反应，已成为缺氧应答时基因表达的调节中心。缺氧时HIF-1Q生成增加，通过调控糖酵解酶、促红细胞生成素、血管内皮生长因子和一些涉及细胞生存蛋白质等的表达，调节能量代谢，增加毛细血管网密度，改善组织血流供应，使细胞产生适应性反应，从而恢复机体内环境稳态。最近研究证实HIF．1Ct能够减弱淀粉样蛋白(Bamylo

4、idpeptide，A13)对神经细胞毒性损伤作用；防止线粒体不可逆抑制剂3．硝基丙酸诱导C6神经胶质瘤细胞损伤以及氧化应激引起的皮层神经细胞凋亡，提示HIF．1Q有可能成为治疗AD等神经系统疾病的一个新靶点。基于以上分析，本研究选用AAV-2为基因载体，人类HIF．1QcDNA中文摘要为治疗基因，构建重组人类缺氧诱导因子．1a腺相关病毒载体(rAAV-HIF．1a)，深入探讨rAAV-HIF．1Q对A1325．35诱导原代培养海马神经细胞凋亡及AD动物模型影响的内在机制，为今后应用rAAV-HIF．1a进行AD基因

5、治疗奠定基础。1pSNAV-HIF．1Q的构建及其转染对AB25．35诱导原代培养海马神经细胞凋亡的影响1．1pSNAV-HIF．1a的构建及表达目的：构建携带人类HIF．1a基因腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV-HIF-1Q，转染原代培养的海马神经细胞检测HIF．1a蛋白表达。方法：采用限制性内切酶KpnI、BamHI双酶切pBSKhHIFlaT7质粒获取人类HIF．1QcDNA全长，插入至pSNAV2．0质粒K

6、pnI、BglII位点，获得携带人类HIF．1d基因的腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV-HIF-1a。

7、实验分为3组：normal组：原代培养的海马神经细胞未作任何特殊处理；HIF-1旺组：原代培养的海马神经细胞转染pSNAV-HIF-1a偈镕酸钙共沉淀法)；vector组：原代培养的海马神经细胞转染pSNAV2．0(磷酸钙共沉淀法)。转染3d后提取细胞核蛋白，Westernblot检测HIF．1a蛋白表达。结果：①酶切、PCR技术证实成功构建了pSNAV-HIF．1Q；(玺)Westemblot检测结果表明，转染3d后HIF．1a组(2176．04±110．56)细胞HIF-1a蛋白的表达量较normal组(812．

8、96-654．27)、vector组(859．43_+72．33)显著升高俨<0．05)，而normal组、vector组细胞相比HIF．1Q蛋白表达无显著性差异。结论：成功构建了携带人类HIF-1Q基因腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV-HIF．1a，转染原代培养海马神经细胞能够高效表达HIF．1a蛋白。1．2pSNAV-HIF．1Q转染对A1325．35诱导原代培养海马神经细胞凋亡的影响目的：观察pSNAV-HIF．1Q转染对AD25．35诱导海马神经细胞凋亡的影响方法：实验分为5组：normal组：原代培养的海马

9、神经细胞未作任何特殊处理；normal+AB组：以终浓度为10／[￡mol／LA1325。35处理原代培养海马神经细胞24h；vector组：原代培养的海马神经细胞转染pSNAV2．0；vector+AB组：pSNAV2．0转染3d后以终浓度为10#mol／LAB25．35处理中文摘要24h；HIF．1d+A13组：pSNAV-HIF-1Q转染