非小细胞肺癌中vegf-c、vegfr-3mrna表达对淋巴结转移和预后的-研究

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1、学位论文独创性及知识产权权属证明学位论文独创性声明本人声明，所呈交的学位论文系本人在导师指导下独立完成的研究成果。文中依法引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。本人如违反上述声明，愿意承担由此引发的一切责任和后果。论文作者签名：贡交∥良日期：功辟j月多同学位论文知识产权权属声明·本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属学校。学校享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请专利等权利。本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直

2、接相关的学术论文或成果时，署名单位仍然为青岛大学。本学位论文属于：保密口，在年解密后适用于本声明。不保密留0(请在以上方框内打“√’’)论文作者签名：首受角氏同期：2卯踔f月知同导师签名：(本声明的版权归青岛大学所有，未经许可，任何单位及任何个人不得擅自使用)35引言肺癌的病因和发病机制的研究历经几十年，虽已取得重大进展，但迄今尚未完全阐明，其发病率和病因学因素在全世界范围内存在很大的地区性差异。血管、淋巴管生成是肿瘤生长和转移的必备条件，与肿瘤的发生、发展和转移有着密切关系。研究肿瘤血管、淋巴管生成对了解恶性肿瘤的发生、发展、侵袭和转移的生物学特性和

3、机理以及抗肿瘤血管、淋巴管生成治疗有重要的理论意义和临床应用价值。众所周知，上皮性恶性肿瘤主要通过淋巴道转移，其转移程度与患者的预后密切相关。由于毛细淋巴管由单层内皮细胞构成，细胞间缺乏紧密连接，且基底膜不完整，甚至缺如，故毛细淋巴管的通透性要比毛细血管大得多，更利于肿瘤细胞的转移。但迄今为止，对于肿瘤组织内是否有新淋巴管生成，淋巴管形成的机理，淋巴管与肿瘤转移的关系等等均尚未清楚。肿瘤组织中的VEGF的过度表达与肿瘤的进展和预后的关系己被众多研究报道所证实，但有关血管内皮生长因子C(VEGF—C)及其受体-3(VEGFR一3)与淋巴管生成和淋巴结转移

4、关系的报道为数不多。血管内皮生长因子C又被称为淋巴管生长因子n1。近来研究发现：(1)VEGF-C具有促血管生成和促淋巴管生成的双重生理作用；(2)VEGF-C可能通过激活恶性肿瘤淋巴管内皮细胞膜上的VEGFR-3弓J起肿瘤周围淋巴管增生，或诱导肿瘤内淋巴管形成，而使肿瘤细胞通过淋巴管进行转移扩散的几率增大；(3)VEGF—C／VEGFR一3mRNA的联合表达与恶性肿瘤的淋巴结转移密切相关。本课题通过研究VEGF-CmRNA、VEGFR一3mRNA在非小细胞肺癌中的表达，试图找到肺癌淋巴结转移和预后的规律，为将来通过阻断VEGF-C／VEGFR-3信号

5、传导通路，来达到抑制肺癌淋巴结转移的目的。资料‘j方法1．1一般资料第一章资料与方法标本耿自青岛大学医学院附属医院胸外科2007年7月至2007年12月经手术切除的新鲜非小细胞肺癌组织60例，以及癌旁6cm以上正常肺组织，切取后立即置于液氮中半小时，然后-70。C低温冰箱中保存，冰冻切片，片厚6

6、lm，用于RT—PCR。所有标本均经临床及病理组织学检查确诊，患者术前未行化、放疗。60例t}／1,细胞肺癌按国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的P-TNM分期标准进行TNM分期，I期18例，lI期ll例，III期25例，Ⅳ期6例；腺癌39例，鳞癌18例，

7、大细胞癌3例；低分化29例，中分化26例，高分化5例；男50例，女-10例；年龄38～76岁，平均年龄52岁。．其中有淋巴结转移32例，无淋巴结转移28例。1．2方法1．2．1试剂及引物RT-PCR法检NVEGr-C及VEGFR一3表达。Trizol试剂盒(GibcoBRL公司产品)，RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司产品)，VEGF-C、VEGFR一3及B～actin的RT-PCR特异引物序列均由上海生物工程有限公司提供。反应条件及引物序列见表1。1．2．2多重RT-PCR将60例标本分别取50～lOOmg冰冻组织放入匀浆器中，加入lmlTr

8、izolRNA提取液迅速制备成组织匀浆后移入1．5mlEppendorf管中，用Trizol试剂一步法(按Trizol操作说明书步骤)提取细胞，总,RNA，499mRNA进入逆转录体系，42。C30min，然后取逆转录产物2．5lJ1进入PCR体系，在同一体系中同时扩增VEGF—C、VEGFR一3、B-actin的三对引物。PCR循环参数为：94。C变性60S，55。C退火60S，72。C延伸90S，共35个循环，最后延伸72。C10分钟以获得更多的扩增产物。以试剂盒提供之对照RNA样品及其特异性引物的扩增产物为阳性对照，以反应系统中不加模板RNA的扩

9、增产物为阴性对照，以B-actin为内对照。PCR反应产物采用1．5％琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)