自噬抑制剂3-ma在顺铂诱导骨肉瘤mg63细胞凋亡中的作用

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1、自噬抑制剂3-MA在顺钳诱导骨肉瘤MG63细胞凋亡中的作用摘要：目的研究自噬抑制剂3-MA在顺钳诱导骨肉瘤MG63细胞凋亡中的作用及其意义。方法培养人骨肉瘤MG63细胞；运用MTT法检测自噬抑制剂3-MA在顺钳诱导下对骨肉瘤MG63细胞的影响；MDC染色法及流式细胞仪检测自噬抑制剂3-MA在顺钳诱导下对骨肉瘤MG63细胞的影响；流式细胞仪检测自噬抑制剂3-MA在顺钳诱导下对骨肉瘤MG63细胞凋亡的变化。结果通过MTT法发现DDP可引起MG63细胞增殖率下降；与单独应用DDP组相比，3-MA+DDP组引起MG63细胞增殖率明显下降;MDC

2、染色及流式细胞仪检测细胞自噬表达，发现与单独应用DDP组相比，3-MA+DDP组自噬表达水平下降；流式细胞术检测发现与单独应用DDP组相比，3-MA+DDP组细胞凋亡率明显增加。结论在自噬抑制剂3-MA的作用下，骨肉瘤MG63细胞自噬表达水平明显下降，从而促使DDP对骨肉瘤MG63细胞的细胞凋亡明显增加。关键词：自噬；凋亡；3-甲基腺卩票吟(3-MA)；顺钳（DDP）；骨肉瘤细胞1实验材料1.1细胞来源骨肉瘤MG63细胞购于中科院上海细胞库。1・2主要试剂3■甲基腺卩票吟（3・MA）、二甲基亚飒（DMSO）、四甲基偶氮卩坐盐（MTT）、

3、单丹黄酰尸胺（MDC）购于美国Sigma公司。Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒购于上海碧云天公司。1・3实验仪器流式细胞仪（美国BD公司）、酶标仪（美国Thermo公司）、倒置荧光显微镜（德国LEICA公司）、低温高速旋转离心机（美国Beckman公司）、细胞培养孔板（美国NEST公司）。1.4试剂配制141MDC溶液将1mgMDC粉末溶于1mL无菌水中，可获得3mmol/L的MDC溶液，取上述溶液100UL加到6mL无菌水中，获得实验用50nmol/L的最终溶液，置于4°C冰箱避光保存备用。142DDP溶液取ImL浓度为5mg

4、/mL的DDP,用无菌水稀释到250mL,即获得20卩g/mL的DDP用于实验，4°C冰箱保存。2实验分组该实验分为4组：空白对照组（加入等量的培养液做对照）、3-MA组（仅添加浓度为12.5Ug/mL的3-MA）、DDP组（仅添加浓度为20ug/mL的DDP）、3-MA+DDP组（12.5ug/mL的3-MA和20ug/mLDDP同时添加）。3实验方法3.1细胞培养骨肉瘤MG63细胞培养于提前配置好的含有10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，其中含有100U/mL的青霉素和100ug/mL的链霉素。在湿度饱和的情况下，培养于5%

5、CO2、37。的培养箱中,隔天换一次培养液，3d传代1次，取适量对数生长期的细胞进行下一步实验研究。3.2MTT比色法外源性MTT在活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶作用下能够还原成蓝紫色结晶甲？，且该结晶物质不溶于水，DMSO可使不溶于水的甲?溶解，在490nm波长处可以用酶标仪检测光吸收值，在死亡细胞中不存在上述反应过程,检测不到吸光度值,从而可以用来比较不同组之间细胞增殖率。取细胞数为IX108个/L,种植于96孔板中，分别在每孔添加等量的细胞悬液，细胞培养液培养10h后根据实验分组在3个组中加入相应的药物，在恒温（37°C）5%CO2

6、的环境下培养24h后，将每孔加入等量的MTT溶液作用4h,然后PBS溶液洗1遍，再加入等量的DMSO溶液，摇摆15min,然后在酶标仪上检测不同组的吸光度值（A）。结合以下公式计算细胞增殖率：细胞增殖率（％）=（实验组A/对照组A）X100%o3.3MDC染色法单丹黄酰尸胺（MDC）被细胞吸收后蓄积于嗜酸性的细胞囊泡中，在荧光显微镜下可以看到蓝绿色或黄绿色点状结构出现在细胞核周围，经常被用来检测细胞自噬囊泡的存在。取处于对数生长期的骨肉瘤MG63细胞（细胞数为1X105个/mL）加入24孔细胞培养板中培养12h待细胞贴壁后根据实验分组加

7、入相应浓度的药物继续培养24h,24h后加入MDC溶液（浓度为50umol/L）避光环境中培养1h,PBS洗涤3次，4%多聚甲醛固定，用PBS洗涤，然后用倒置荧光显微镜观察自噬空泡差异；同样方法，经相应药物处理24h后，MDC染色、4%多聚甲醛固定，PBS洗涤，然后分别收集各组细胞（不荧光强度），用流式细胞仪检测不同组细胞荧光强度。能收集倒置荧光显微镜观察过的细胞,以免影响细胞3.4流式细胞术检测细胞凋亡率磷脂酰丝氨酸位于正常细胞膜的内侧，但是在细胞凋亡的初期，磷脂酰丝氨酸从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，岀现在细胞外环境中，也就是所谓

8、的磷脂酰丝氨酸外翻。Annexin-V是一种分子量为35〜36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,能与磷脂酰丝氨酸高亲和力特异性结合。Annexin-FITC/PI凋亡试剂盒是用带绿色荧光灯荧光探针FITC标