米氏常数测定方法

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1、酶活米氏常数实验一、实验前准备1、24孔板洗净烘干，准备足够枪头。2、准备催化剂，在光下呈透明状为分散性较好，否则用超声清洗器（位于化学间）超声分散5min，期间准备底物（如TMB或者ABTS），浓度依照自己实验的要求定（10mg/mL或5mg/mL），一般1mL足够用，可在1.5mL离心管中溶解。TMB（外间冰箱上层）溶于DMSO（二甲亚砜，位于化学间王春雨的柜子里），ABTS（与TMB放在一起）溶于二次水。3、将缓冲液、催化剂、底物、H2O2、200µL和10µL移液枪、50µL排枪（位于称量处上方模拟酶专用枪的柜中

2、）、96孔板、24孔板、卷纸一起放入纸盒中，放到对面酶标仪前，开空调定室温（25℃，提醒其他人随手关门），24孔板中其中一排加入适量H2O2（每孔1mL左右，注意避光，可在板上盖一张卷纸），将缓冲液、催化剂、底物放实验台上，静置0.5-1h。4、记录本上提前写好实验的加样顺序：催化底物TMB（或ABTS）的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液②10µL催化剂③底物TMB（ABTS）(0，0.5，1，2，4，6，8，10µL)④32µLH2O2（排枪加）催化底物H2O2的酶促动力学过程加样顺序：①200µL缓冲液②1

3、0µL催化剂③H2O2（2，4，6，8，10，16，32，64µL）④10µL底物TMB（ABTS）（排枪加）数据记录按下表记，Code为每次读板时的微孔板编号，Time为对应的读板时的时间，一般30s读板一次，可根据反应的快慢来确定读板的时间。Code1234567TimeTMB00.51246810V01Code1234567TimeH2O2246810163264V01二、实验1、打开酶标仪（开关在仪器后部，若仪器没反应，请检查电源是否接通），密码为5个0，按Enter键进入系统。电脑开机，密码为mby-nano，

4、双击酶标仪软件图标，出现登录框，直接点击“登录”，进入酶标仪控制界面，若底物为TMB，选择“铁动力学”(波长为650nm)，选择模板1；打开电脑内置时钟，若底物为ABTS，则检验项目选择“gg”（波长为405nm）。新建一个word文档，以日期命名，打开。2、加样：96孔板从左至右编号为1-12，自上而下编号为A-H。以TMB为例，从第1列加样：①从A1至H1，每孔加200µLNaAc/HAcBuf；②从A1至H1，每孔加10µL催化剂（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；③从A1至H1，每孔分别加不同体

5、积（0，0.5，1，2，4，6，8，10µL）TMB（每加一个孔，换一次枪头，加样时用枪头搅匀反应体系）；④用排枪吸取32µLH2O2加入A1至H1，快速放入酶标仪中，点击“读板”，记下读板时间（如下表所示，假设第一次读板时间为09：00：00）Code1234567Time00：0000：3001：0001：3002：0002：3003：0003：30TMB00.51246810V01用排枪加H2O2时，注意检查枪头是否插紧，否则会导致吸取H2O2的量不足。亦可先将96孔板放入酶标仪，再加H2O2，这样可以节约时间。每

6、次读板出来结果后，点击“结果入库”——>“是”——>“确定”，按下“PrintScreen”键，点击“退出”，打开word文档，ctrl+V或者右击选“粘贴”，保存结果，要留意下次读板的时间。若遗漏某个模板没有保存，可点击“查询结果”，下拉框中选择目的模板编号即可。(现已可以直接拷吸光值读取数据，按ctrl键点击该处文字见方法)3、第一组数据保存后，将第一组的反应液倒掉，用卷纸将边上的液体擦干。第二、三、四组同第一组的操作。保存所有数据，拷贝到U盘里，整理实验台，关掉酶标仪、空调和电脑。4、若当天不再继续实验，将24孔板

7、中剩余的H2O2倒掉，用清洁剂洗后，再用二次水冲洗一次，放入烘箱中烘干。移液枪放回原处，催化剂、底物和H2O2放入冰箱中保存。三、数据处理1、打开Origin6.1，点击右上角的“AddNewColumn”（箭头所指）：，亦可右击——>AddNewColumn。2、输入数据：命名各列，X列命名为时间，单位s，8个Y列分别为8个孔的编号。X列时间从0-180s，0s对应微孔板编号1的数据，30s对应code2的数据，以此类推，将所读数据输入。点击“file”—>“SaveProjectAs”，保存文件名为“第一组”。3、数

8、据输入完成后，选择X和Y列，点击左下角的“点图”标志（箭头所指）作出点图，点击Analysis—>FitLinear作线性拟合，在结果对话框里，拟合的方程为Y=A+B*X，B的值为拟合得出的斜率即反应的初速度V，同样方法得出不同TMB体积对应的反应初速度V，记录数据：Code1234567Time00：0000：30