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1、实验四质粒DNA的提取、电泳检测和酶切一、实验目的学会用碱裂解法小量制备质粒DNA。二、实验原理质粒DNA是存在于细菌中的环状小分子DNA,不同于长链大分子的基因组DNA,游离于细胞质中。由于细胞屮的RNA可以被降解，大分子DNA可与细胞碎片一起沉淀而与质粒DNA分离。质粒DNA的提取常用碱裂解法、煮沸法、SDS法、Triton-溶菌酶法等，其中以碱裂解法最为常用。本方法有质粒DNA产呈高、快速等优点。其原理为：在碱性溶液中，双链DNA^t键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不
2、会充分分离，当加入屮和缓冲液调时，染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质一SDS复合物结合在一起；当K+取代Na+时，生成不溶的PDS，这些复合物从溶液屮沉淀下来。通过离心沉淀，细胞碎片、染色体DNA及大部分蛋白质可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNA酶（RNAase）消除。再用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质。三、实验材料含有质粒pUC19的大肠杆菌菌株DH5a。四、实验器具、药品试剂A、实验材料：•DH5a受体菌•pUC19B、实验仪器•高压灭菌锅•超净工作台•恒温摇床取•台式离
3、心机（冷冻或非冷冻式）•旋涡振荡器•电泳仪•凝胶成像系统•培养用试管•量筒•冰盒•微量取液器（2ul，20ul,150ul,lOOOul）•吸管头若干(2ul,20ul,150ul,lOOOul)•EP管若干•一次性手套若干C、溶液药品：•LB培养基•氨"T•青霉素(Amp,100mg/ml)•20%SDS•4MNaOH•3MNaAc(pH5.2)•异丙醇•TE缓冲液(pH8.0)•RNAaseA(10mg/ml)•70%乙醇•无水乙醇•75%乙醇，•NEB标准分子量片段(lkbDNALadder),•EcoRl及DmI(Drall?)限制性核酸内切酶(TaKaRa),
4、•EcoRi酶解缓冲液(10xHbuffer)•10%琼脂糖•电泳缓冲液•EB染色液溶液I一GET缓冲液：50mmol/L葡茹糖，10mmol/LEDTA，25mMTris-HClpH8.0。溶液II(现配现用)一0.2mol/LNaOH,1%SDS溶液III(4°C预冷)一乙酸钾洛液(3M,5M?pH=4.8)：60mL的5mol/LKAc，11.5ml冰醋酸，28.5mLH2OTE缓冲液或双蒸水(+20pg/mlRNase):10mmol/L,Tris-HCl,1mmol/L,EDTA，pH8.0，五、实验方法（一）质粒DNA的提取1在超浄工作台上将2份5ml含有5
5、0ug/mLAmp的LB培养液加入己灭菌的试管中，2挑取数个单菌落（含有50ug/ml氨苄的LB平板，含pUC19质粒）的DH5a菌液，接入上述5mL含有氨苄青霉素（50）ig/ml）培养基中，37°C摇床150rpm培养5小时，培养基明品浑浊。3取1.5ml菌液于1.5ml离心管中，12000r/min离心2min,去上清液。4在沉淀中加入150…溶液I，盖上盖后在漩涡振荡器上混匀，充分悬浮菌体，置冰上5min。5加入300
6、il新配制的溶液II（变性液），加盖颠倒6-7次使之混匀;不要强烈混匀。置冰卜.5min。6加入225pr溶液III,加盖后颠倒6-7次，加盖颠
7、倒6-7次使之温和混匀，置冰上15min。712000r/min离心5min，上清移入另一干净离心管，加入等体积的鉍仿/异戊醇（12:1），反fi倒罝2min，充分混匀；812000r/min离心10min,上清移入另一干净离心管，并加60%体积的异丙醇混匀，12000r/min离心10min,弃去上清液（注意沉淀的位置）；9沉淀加1ml70-75°%乙醇，倒貫1-2次，10000r/min离心5min,弃去上清液，可见黄色沉淀块。重复上述洗盐过程一次。小管倒罝于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥（10-15分钟），至管壁内无水珠；10其中一份加入20pi含有20（jg/
8、mlRNase（无DNAse）的TE缓冲液溶解提取物，另一份加入20piTE缓冲液溶解提取物，反复弹离心管100次，lOOOrpm离心20秒。（RNase处理方法：Takara,10mg/ml,先将RNase用其自身稀释液稀释50倍至200ug/ml,去2ul加入20ulTE,其终浓度为20ug/ml。）11将分离出的质粒DNA置于-20°C保存备用。（二）质粒DNA质量检测琼脂糖凝胶电泳检测，原理和方法见实验一和实验三。电泳结果：RNase处理的结果中没有RNA，pUC19质粒两条带清晰，大小正常。没有RNase处理的结果中有大量RNA
