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《将玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因转入到枯草芽孢杆菌内表达的实验步骤》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、将玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因转入到枯草芽孢杆菌内表达的实验步驟1,在GenBank中查出玉米赤霉烯酮毒素降解酶基因序列ATGCGCACTCGCAGCACAATCTCGACCCCGAATGGCATCACCTGGTACTATGAGCAGGAGGGTA2,设计引物？？？3,蜡样芽胞杆菌的培养基，选用营养肉汤培养基（蛋白胨10g,牛肉粉3g,氯化钠5g,PH为7.2土0.2加热溶解于1000ml蒸馏水中，分装三角瓶或试管，121°C高压灭菌15分钟备用）。CTGGACCCGACCGTGTCGCACCCGGTCTGCACATCAAGCATGCTCGGTTATGGACCACCTATGTAATGTTCGTT
2、GTCCTCGATTGCTGCTCAAGGCACCACGCTACTGTCCCCCGACAGGTTCAAACACCGAACGACGTGGTTCCCGATGCAAGGCTTGACCCGAGACCTTGGGGCTGCAATACGCAACGGCTGTGCTCGTCTGGAGGCTGCCTCGGAGAGGGTCACTACACACTGTCATGCTCAGGAGCCCATGTGCCAAAGACGAGGACGGAGGCGTGATGCCAGATGGTTTGATATGCTCCGTCCTGTTCCACCGTCCGAACTGCCAAATCTCAAAGGCAAGCCATGTTTGACAGCTCCCGGAATGAGATG
3、CTCTTGGTGGCGCTGTACAAAGCTACATCCTGGCCA蜡样芽胞杆菌的生态习性：兼性好氧。生长温度范围20〜45°C,10°C以下生长缓慢或不生长。存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。在葡萄糖肉汤中厌氧培养产酸，从阿拉伯糖、甘露醇、木糖不产酸，分解碳水化合物不产气。大多数菌株还原硝酸盐，50°C时不生长。在100°C下加热20min可破坏这类菌。4,①、取蜡样芽胞杆菌的培养液4ml,用Trizol试剂对其进行裂解：提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5~106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈震荡以裂解细胞；②、将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中，
4、在室温15~30°C下放置5分钟；③、在上述EP管中，按照每1mlTrizo丨后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15~30°C）放置2~3分钟后，12000g（2~8°C）离心15分钟；④、去上层水相置于新EP管中，按照每1mlTrizo丨加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15~30°C）放置10分钟后，12000g（2〜8°C）离心10分钟；⑤、弃上清，按照每1mlTrizol加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2~8°C）离心5分钟，弃上清；⑥、让沉淀的RNA在室温在自然干燥；⑦、用Rnase-freewater（去核糖
5、核酸酶水）溶解RNA沉淀。加RNA抑制剂存于-80度冰箱备用5,以上述步骤提取的mRNA为模板用反转录试剂盒合成cDNA.反转录体系：？？？？6,以反转录的cDNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系：10XBu幵er(不含Mg离子)4uL,MgC12(25mmol/L)2.5uL,dNTP(2mmol/L)4uL,引物(3mmol/L)各1uL,DNA聚合酶(5U/uL)1uL,模板DNA(5ng),用无菌双蒸水补足至40uL,PCR反应条件为：94°C预变性5min;(94°C1min,54°C45S,68°C1min)共30个循环，68°C10min，4"C保温。反应结束后，用1.5%
6、的琼脂糖凝胶电泳检测7、枯草芽孢杆菌重组表达载体的构建8,枯草芽孢杆菌的感受态细胞的制备培养基，选用GM培养基枯草芽抱杆菌感受态制备用培养基(1)10mLGMI1mL10XSpizizensalts0.1mL10%酵母粉，0.25mL20%葡萄糖，0.2mL1%水解酪蛋白，0.2mL0.25%所需氛基酸，补充灭菌蒸馏水至总体枉10ml(2)10mLGM21mL10XSpizizensalts0.OSmL10%酵母粉，0.25mL20%葡萄糖，0.04mL1%水解酪蛋白，0.2mL0.25%所需氨基酸，0.OSmL0.1mol/LCaCI2,1mL25mmol/LMgCI2,补充灭菌蒸馏水至总体
7、积10ml挑取一新鲜培养的枯草芽抱杆菌单菌落接种于2.5mLGMI培养基中，30度130-150r/min振荡培养过夜;将过夜培养物按10%接种量接种于2.5mL新鲜的GM丨中，37度200-230r/min振荡培养3.5h再将培养物进行第二次传代，接种于5mLGM2培养基中，按5%接种量进行第二次传代，37度200-230r/min振荡培养90min取1mL培养物，5000r/min室温离心5m
