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1、XX大学毕业论文靶向Livin的siRNA提高MDAMB231细胞对阿霉素敏感性的可能机制姓名：2014年6月25日靶向Livin的siRNA提高MDAMB231细胞对阿霉素敏感性的可能机制作者：李凡王小毅田甜陈力李佳任国胜【摘要】目的：采用RNA干扰技术下调Livin基因的表达，观察其提高乳腺癌细胞对阿霉素化疗的敏感性及机制.方法：构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体，转染乳腺癌细胞MDAMB231后,通过实时定量PCR,WesternBlot技术检测干扰前后Livin和Caspase3的表达；采用MTT法检测细胞增殖的变化以及细胞对阿霉素
2、的半数抑制浓度(IC50),流式细胞法检测细胞周期，TUNEL法检测其诱导细胞对阿霉素化疗增敏作用，并观察细胞超微结构变化.结果：成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体，siLivin2对Livin的mRNA和蛋白抑制效率最高，分别为76.4%和70.2%,同时Caspase3的mRNA和蛋白表达升高约157.1%和38.6%(P0.05).siLivin2转染48h后，与未转染组相比，细胞增殖活力受到抑制，siLivin2联合阿霉素使细胞周期阻滞于G0/G1期(P0.05),显著提高了细胞对阿霉素敏感性，其凋亡率达到(3&35±2
3、・64)%,IC50降低为(2.46±0.87)mg/L,差异具有统计学意义(P0.05).透射电镜下可见细胞胞质浓缩，染色质聚集为小团块，电子密度增高.结论：靶向LivinsiRNA真核表达载体可以有效地下调MDAMB231细胞Livin基因的表达，并且通过上调Caspase3的表达抑制细胞增殖，显著增强其对阿霉素的敏感性.【关键词】乳腺肿瘤；Livin基因；RNA干扰；阿霉素0引言Livin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein,IAP)家族的新成员，它在肿瘤组织中特异性表达并具有强大的抗凋亡作用，已成为肿瘤基因
4、治疗新的靶点［1］.近年的研究［2］认为，凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要模式，IAP家族在调节肿瘤细胞对凋亡敏感性方而起着核心作用.而特异性阻断肿瘤细胞内高表达的Livin基因，可以抑制细胞增殖并增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［3］,但其化疗增敏作用的发牛机制尚不明确.我们通过构建靶向Livin的siRNA真核表达载体，传染乳腺癌细胞MDAMB231,观察Livin表达下调对细胞阿霉素化疗敏感性的影响，并探讨其发生的可能机制.1材料和方法1」材料人乳腺癌细胞株MDAMB231（中科院上海细胞资源中心）；shRNA质粒载体pGcncSil1（武汉晶
5、赛公司）；LipofcctamincTM2000（美国Invitrogen公司）；质粒提取试剂盒（美国Omega公司）；总RNA提取试剂、实时定量PCR扩增试剂（大连TaKaRa公司）;兔抗人多克隆抗体Livin（美国Imgenex公司）；兔抗人多克隆抗体Caspase3,辣根过氧化物酶标记羊抗兔多克隆抗体（北京中杉生物技术有限公司）；TUNEL检测试剂盒（徳国Roche公司）.1.2方法1.2.1靶向Livin的siRNA真核表达载体的构建利用Ambion公司在线设计程序，针对GenBank中Livin（No.NM022161,No.NM139317
6、）的共同序列，筛选出三条干扰序列，即siRNA1:5，CTGGCCTCCTTCTATGACT31siRNA2：5，GGAAGAGACTTTGTCCACA3'；siRNA3:5，CCGTGTCCATCGTCTTTGT3Z；同时设计非特异性靶序列:5，GACTTCATAAGGCGCATGC3将化学合成的正义链和反义链退火，与经Hindlll和BamHI酶切后线性化的pGeneSil1载体连接，经筛选，酶切鉴定后测序.所得质粒命名为siLivin1,siLivin2,siLivin3和siHK.1.2.2MDAMB231细胞的培养和转染MDAMB231细胞
7、用含100mL/L胎牛血清、1x105U/L青霉素和“105U/L链霉素的RPMI1640培养液，于37°C,50mL/LCO2的恒温箱中培养传代.转染前将细胞接种于6孔板，待细胞生长至密度为70%〜90%时，按照LipofcctamincTM2000说明书转染重组质粒.1.2.3实时定量PCR检测细胞接种于6孔板，分为未转染组，siHK组，脂质体组，siLivinl组，siLivin2组和siLivin3组.转染48h后收集细胞,按照试剂说明书提取细胞总RNA.以cDNA为模板，进行实时定量PCR反应.PCR扩增条件:95°C10s,l个循环；95°
8、C5s,60°C31s,40个循环;95°C15s,60°C60s,95°C15s,l个循环.
