自制质控品在实时荧光法hbv-dna定量室内质控中的应用

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1、自制质控品在实时荧光法HBV-DNA定量室内质控中的应用尚小云(辽宁省抚顺中心医院检验科113006)【摘要】目的研究实时荧光Sfi：(RT-PCR)检测乙肝病毒核酸(HBV—DNA)时，自制质控品的扩增循环阈值(CT)作为靶值在室内质控中应用的可行性。方法留取己知HBV—DNA浓度的患者血清和甲、乙、丙、戊肝和HIV血清学标志物全阴性的患者血清，通过一定比例稀释得到预期浓度的质控物，分装并-70°C保存。分别计算出靶值，标准差和变异系数(OCV%、RCV%)，以CT值在±2S为质控警告线±3S为质控失控线，

2、绘制Levey—jennings质控图。分析结果质控物最佳条件下的、S和OCV分别为27.5、0.65和2.36%;常规条件下的、S和RCV分别为28.7、0.73和2.54%。RCV值<2OCV值，此RCV可以接受。结论自制质控品的CT值作为靶值应用于RT-PCR法HB—VDNA定量的室内质控中，制图方便，结果准确可靠，可以推广。【关键词】HBV-DNA扩增循环阈值室内质控【中图分类号】R446【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2013)51-0159-02实时荧光定量PCR具有特异性强，能有效解决PCR产物污染、

3、自动化程度高等特点。在临床PCR检验中，通常使用质控样木扩增后的“拷贝数/ml”或“U/ml”来进行质控数据的统计分析［1］，但应用起来很不方便，木研宄试用自制血清质控品的扩增循环阈值(CT)绘制质控图，研究其在HBV-DNA检测室内质控中的应用价值。1材料和方法1.1材料1.1.1质控品来源：质控血清来自抚顺市中心医院门诊和住院患者血清，经乙肝五项和甲、丙、戊肝血清学标志物全阴性的患者血清20人份；已知HBV-DNA检测结果为5.67×106IU/ml的血清样木一份。以上血清均无肉眼可见的脂血、溶血和黄疽，将其进行56°C

4、30min火活处理。1.1.2仪器设备：德国凯杰Rotor-GeneQ实时荧光定量PCR分析仪。高速低温离心机，恒温金属浴，振荡器和加样枪等。1.1.3试剂来源：HBV—DNA提取和扩增试剂盒来自凯杰生物技术奋限公司。1.2方法1.2.1质控品制备:已知HBV-DNA检测结果为5.67×106IU/ml的血清样本200μL与肝炎血清学标志物全阴性的患者血清19.8ml充分混合，检测预期浓度在5.00×104IU/ml左右。1.2.2质控品分装：为保证质控品均一性，要将其充分混匀。制备和分装所有操作均在生物安

5、全柜内进行。1.2.3质控品的检测1.2.3.1最佳条件下的变异(OCV):在仪器和试剂均为最佳状态下，由操作熟练的有多年PCR工作经验的技术人员进行操作，连续测定1.2.2中的质控品20次，得到一组CT值数据，经计算可得到其均值⑺、标准差⑸和变异系数(CV)，此变异系数即为OCV。1.2.3.2常规条件下的变异(RCV):在仪器和试剂均为通常状态下，由经过培训的普通技术人员进行操作，连续测定1.2.2中的质控品20次，得到一组CT值数据，经计算可得到其均值⑺、标准差⑸和变异系数(CV)，此变异系数即为RCV。1.2.4质控图绘制：以C

6、T值在±2S为质控警告线，±3S为质控失控线，自动得到Levey—jennings质控图，分析结果。2结果2.1准确性评价：每批次实验同吋做空白对照、阴性对照和弱阳性对照和各一份，标准品4份，分别为107，106,105,104IU/ml。实验结果空白对照和阴性对照均为阴性结果，弱阳性对照在试剂说明书可接受范围内，标准品呈线性关系(R2>0.98＞。表明每次实验均在控。2.2最佳条件下变异(OCV)与常规条件下变异(RCV)结果：RCV值与OCV值比较接近，两组均数t检验差异无统计学意义(P>0.

7、05)。并HRCV值<2OCV值，因此RCV可接受，见表I。3讨论表I最佳变异与常规变异结果对比3.1近影响临床基因扩增实验室室内质控的因素很多［2］，本文仅就采用RT-PCR方法进行HBV—DNA定量的室内质控物的制备及质控曲线的绘制进行分析和阐述。3.2考虑到试剂厂家提供的质控品成本较高，自制血清质控品具奋如下优点：A.基质与检测标本一致。B.可单批大量获得。C.有良好的稳定性。D.自定义质控浓度。E.无已知的生物传染危险性。以上符合用于临床PCR实验室内质控理想的质控品应具备的条件［3］。3.3在实时荧光定量PCR过程中，获

8、得的病毒母数据都很大，通常用对数值做质控分析，较为繁琐。CT值是指每个反应管荧光信号达到设定的阈值吋所经历的循环数，与模板起始拷W数的对数存在线性关系［4】，可以代替定量结果的对数作为质控数据使用，每次实验