2007年研究生高级生化技术

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1、高级生化技术中山医学院生物化学与分子生物学教研室钱艳Email：qianyan@mail.sysu.edu.cn实验二PCR试剂盒检测HBVDNA实验分组，认清试剂（每2人做一管，2阳性管）患者血清40l+40lDNA提取液，混匀沸水浴10min，10000rpm×5min（离心机的使用）取上清2l（或阳性血清2l）加入一PCR反应管6000rpm×5s，混匀一、实验操作及注意事项93℃×3min预变性(HemaPCR仪的使用与程序设计)93℃×45s，55℃×35s，72℃×60s重复25个循环72℃保温5min，-20℃保存备用二、PCR基本原理及相关知识概念聚合酶链反应（p

2、olymerasechainreaction，PCR）是一种体外扩增特异DNA片断的技术,能在短时间内获得数百万个特异DNA序列的拷贝。KaryMullisPCR技术最早由美国Cetus公司人类遗传研究室KaryMullis及同事于1985年发现并研制成功的。KaryMullis因发明了“聚合酶链式反应”而获得1993年度诺贝尔化学奖。相对DNA克隆而言，这种方法的特点：操作简便、时间短、特异性高、灵敏度高、实用性强；广泛的应用于医学诊断、分子生物学、分子克隆、基因诊断、法医学、考古学等各个领域。PCR扩增DNA片段的原理PCR是在模板DNA、引物和四中脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚

3、合酶依赖的酶促合成反应，整个扩增过程分三步：①变性：加热，模板DNA形成两条单链②退火：降温，模板单链DNA与引物配对结合③延伸：在DNA聚合酶及镁离子等存在的条件下，引物3'-端向前延伸，合成与模板配对的新链上述三步为一个循环，经过一个循环DNA量增加一倍。新合成的链又可以成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后目的DNA就可以扩增106~109倍。通过循环可以提高PCR的特异性。PCR反应体系的组成及功能PCR的完成是在一个0.5ml的EP管中完成，一个完整的PCR反应体系应包括以下成分：模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。相对

4、于分子克隆、酶切、连接、标记等，PCR对DNA模板纯度的要求并不严格。模板用量也是很低的，一般认为102~104拷贝模板就可以满足要求。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。引物：是预扩增DNA片段两端的已知序列，是保证PCR特异性的关键因素，引物浓度：0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。TaqDNA聚合酶有良好的热稳定性，具有5‘-3’聚合酶活性和3‘-5’外切酶活性，因此。它对核苷酸的错配是没有校正功能。其活性对Mg2+浓度非常敏感终浓度一般为：2.5u/100ul，酶量增加使反应特异性下降；酶量过少影响反

5、应产量。dNTP：已有商品化的混合液，终浓度一般为20~200umol/L。10×PCR反应buffer：已作成商品化的产品，它包括：250~500mmol/LKCl；100~500mmol/LTris-HAC（pH8.4）；15~20mmol/LMgCl2（对Taq酶的活性影响很大，一般浓度为1.5~2.0mmol/L，实际应用时根据反应体系的情况进行调整。）；0.1%明胶或牛血清白蛋白ddH2O调节反应体积液体石蜡油影响PCR的主要因素①PCR反应体系的各个组分②PCR循环的温度（预变性、变性、退火、延伸）③PCR循环的次数和平台效应④操作环境平台效应及其原因实验三核酸和蛋白紫

6、外分光光度法定量测定分光光度技术是利用物质特有的吸收光谱对其进行定性、定量分析的实验技术。一、分光光度技术光学光谱区远紫外近紫外可见近红外中红外远红外（真空紫外）10nm~200nm200nm~380nm380nm~780nm780nm~2.5m2.5m~50m50m~300m电磁波谱氢灯复合光(阳光及钨灯)发射光谱红橙黄绿青蓝紫单色光三棱镜可见光分光光度计光源紫外分光光度计光源高低二、有关光学原理1.吸收光谱在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱。透射光入射光反射光被物质吸收的光光吸收基本定律

7、:Lambert-Beer定律A=lg(I0/It)=kbcItI0bdxII-dIs朗伯定律(1760)A=lg(I0/It)=k1b比尔定律(1852)A=lg(I0/It)=k2c吸光度介质厚度(cm)Lambert-Beer定律D＝KCL吸光度摩尔消光系数吸收物质的光径（cm）溶液浓度（mol/L）722型分光光度计结构方框图光源吸收池检测系统分光系统利用分光光度法对物质进行定量测定的方法。（一）标准曲线法（二）标准管法三.