高级生化技术实验.ppt

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1、高级生化技术实验食品与生物工程学院生物化学实验室实验内容安排40学时实验一鸡卵类粘蛋白的分离与纯化实验二SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量实验三凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量实验四离子交换层析技术分离单核苷酸掌握生物化学的基本知识、基本理论及基本实验技能；培养分析和解决问题能力以及严谨细致的科学作风、创新能力等综合素质；掌握蛋白质、酶、核酸、糖等重要物质的分离、纯化和测定技术的原理及方法；实验目的通过实验应该做到学习设计实验的基本思路，掌握各个实验的基本原理，学会严密地组织自己的实验，合理地安

2、排实验步骤和时间。训练实验的动手能力，学会熟练地使用各种生化实验仪器。学会准确翔实地记录实验现象和数据的技能，提高实验报告的写作能力，能够整齐清洁地进行所有的实验。掌握生物化学的各种基本实验方法和实验技术，尤其是电泳技术和层析枝术，为今后参加科研工作打下坚实的基础。实验前应认真预习，写好实验预习报告。实验中应及时准确地记录所观察到的现象和测量的数据。实验预习报告格式①实验原理②实验方法与步骤（表格或流程式）③主要仪器、材料④实验数据记录表格⑤预习遇到的问题实验记录与实验报告实验记录与实验报告实验报告是学生实

3、验研究结果的记录和总结，同时也是评价学生实验课成绩的重要依据。实验报告的格式①实验目的②实验原理③实验方法与步骤④实验数据记录、处理及结果分析⑤思考题⑥讨论、心得注意：实验结果的讨论要充分，尽可能充分运用己学过的知识和生物化学技术原理，进行深入的探讨，勇于提出自己独到的分析和见解，并欢迎对实验提出改进意见。考核方式与评分方法采取“学生实验平时考核”的方法进行实验考核。评分方法采用百分制，每个环节都制定了评分标准（见高级生化技术实验评分标准）,各实验项目总成绩的平均值就是实验的成绩。实验成绩＝[∑（预习成绩×

4、10℅＋实验过程成绩×40%＋报告成绩×50℅）]／N预习报告10℅实验过程40℅实验报告50℅N为所做实验项目的总个数实验一鸡卵类粘蛋白的分离与纯化【目的要求】掌握从鸡卵清中提取鸡卵类粘蛋白的原理及方法。了解凝胶过滤层析的工作原理，掌握基本操作技术。掌握离子交换层析的工作原理及基本操作技术。鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白，它具有强烈的抑制蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶。另外，还可用于分离纯化麦胚凝集素。【实验原理】鸡卵类粘蛋白在中性

5、及偏酸性溶液中较稳定，对热、高浓度脲及有机溶剂均有较高的耐受性，在10％三氯乙酸或50％丙酮溶液中有较好的溶解度。本实验采用选择性变性沉淀、凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析等方法分离纯化鸡卵类粘蛋白。选择性变性沉淀在鸡蛋蛋清中，加入10％TCA溶液作为初步分离，在pH3.5的条件下，杂蛋白变性沉淀，离心后，上清液中含有鸡卵类粘蛋白。离子交换层析纯化不同蛋白质pI不同，在同一pH溶液中其电离有所不同，利用DEAE-纤维素离子交换柱层析，可将目标蛋白与杂蛋白分开。从而使鸡卵类粘蛋白得到进一步纯化。凝胶过滤柱层析蛋

6、白质相对分子质量较残留丙酮及TCA大的多，选择SephadexG-25依分子筛效应，可去除粗分离样品中的小分子。透析纯化离子交换层析后，样品中盐的质量较高，需要脱盐才能得到纯品，一般采用透析的方法。蛋白质含量的测定鸡卵类粘蛋白在280nm处的消光系数=4.13，即蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A280=0.413，据此可以测定其蛋白质的含量。【操作方法】一、鸡卵类粘蛋白的提取1)取1个鸡蛋蛋清，加入等体积的10％TCA溶液，充分搅匀后，测定溶液的pH值（精密pH试纸），若偏离3.5，用10％NaOH

7、溶液调pH3.5，室温静置4h以上。2)3000r/min离心10min。收集清液，再用滤纸过滤并检查滤液的pH值是否3.5，若不是，则要调整。滤液量体积后转入500mL烧杯内，缓慢加入3倍体积冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，置冰箱放置过夜。3)小心虹吸出部分上清液，剩余浑浊液转入50mL离心管中，3500r/min离心10min，弃清夜，将沉淀抽真空去净丙酮。4)量取100mLSephadexG-25,加入200mLpH6.5的磷酸盐缓冲液，沸水中1h。冷却后脱气。7)取上述蛋白粗提液上SephadexG-

8、25层析柱。控制流速15d/min，待样品全部入床后，用同样的缓冲液洗脱，收集第Ι峰。在蛋白峰流出后盐及杂质才开始流出。5)装柱（25×300mm）用约2倍体积的0.02mol/L,pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。直至流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线。6)离心管中加入20mL蒸馏水溶解，若溶解液浑浊，可用滤纸去掉不溶物。二、鸡卵类粘蛋白的纯化处理离交剂量取DEAE-纤维素粉（DE-32）50mL，用100mL0.