高级生化实验报告

《高级生化实验报告》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白实验报告一、实验背景印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southem建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southernblotting。之后,JamesAlwine、DavidKemp和GeorgeStark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southernblotting相似，故命名为Northernblotting。GeorgeStark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测

2、方法。1981年，在NealBurnette所著的AnalyticalBiochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Westernblotting。此后开发的Easternblotting是Westernblotting的变形，对双向电泳后蛋口质分子的印迹分析称为Easternblotting。30多年来，Westernblotting技术已成为蛋白质研究屮最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在（定性），目的蛋白质的表达量和不同样品之间的表达差异性（定量）。免疫印迹法（Westernblotting）是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交

3、技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针“是抗体，“显色"用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以I古I相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,

4、经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。pET系统是在大肠杆菌（Escherichiacoli）中克隆表达目的基因、产生重组蛋白的经典表达系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导oT7RNA聚合酶被充分诱导吋，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白实验报告一、实验背景印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975

5、年，Southem建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southernblotting。之后,JamesAlwine、DavidKemp和GeorgeStark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southernblotting相似，故命名为Northernblotting。GeorgeStark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。1981年，在NealBurnette所著的AnalyticalBiochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Westernblotting。此后

6、开发的Easternblotting是Westernblotting的变形，对双向电泳后蛋口质分子的印迹分析称为Easternblotting。30多年来，Westernblotting技术已成为蛋白质研究屮最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在（定性），目的蛋白质的表达量和不同样品之间的表达差异性（定量）。免疫印迹法（Westernblotting）是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。免疫印迹法具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。

7、与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针“是抗体，“显色"用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以I古I相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于