高级生化实验报告二

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1、实验二Westernblotting检测大肠杆菌重组蛋白一、背景印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southernblotting。之后，JamesAlwine、DavidKemp和GeorgeStark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southernblotting相似，故命名为Northernblot

2、ting。GeorgeStark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。1981年，在NealBurnette所著的AnalyticalBiochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Westernblotting。此后开发的Easternblotting是Westernblotting的变形，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Easternblotting。30多年来，Westernblotting技术已成为蛋白质研究中最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在（定性），目的

3、蛋白质的表达量和不同样品之间的表达差异性（定量）。pET系统是在大肠杆菌（Escherichiacoli）中克隆表达目的基因、产生重组蛋白的经典表达系统。目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导。T7RNA聚合酶被充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。目的蛋白可用于进一步的SDS-PAGE分析、Westernblotting检测或亲和层析分离纯化。二、实验目的

4、利用WesternBlotting技术，定性检测苦荞二氢黄酮醇4-还原酶基因（FtDFR）在E.coliBL(DE3)中的诱导表达。三、实验原理采用PCR技术，在苦荞FtDFR基因ORF起始密码子前引入KpnІ酶切位点，终止密码后引入SalⅠ酶切位点。PCR产物与pET-30b（+）质粒进行体外重组，获得重组质粒pET-30b-FtDFR，设计其表达产物在N-末端含有6×His标签。重组质粒经鉴定后转化表达宿主菌E.coliBL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达，分别收集诱导0h、2h、4h、6h

5、和8h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Westernblotting分析。Westernblotting的实验流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE凝胶电泳分离，进一步通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定后含有特定抗原的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体发生抗原-抗体反应，并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-HistagIgG，一抗）与

6、重组FtDFR蛋白的N-末端的6×His发生抗原-抗体特异反应，利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-GoatAnti-MouseIgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3,3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Westernblott

7、ing等膜显色中应用广泛。四、操作步骤1样品的制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。1.1材料与试剂：基因工程菌重组E.coliBL21(DE3)pET-30b(+)-FtDFR；LB固体培养基（Kan50μg/mL）LB液体培养基（10mL、50mL）Kan（50mg/mL）IPTG（24mg/mL）PBS缓冲液：137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4,2mMKH2HPO

8、4,pH7.4；5×SDS上样缓冲液（pH8.0）：250mMTris-HCl(pH6.8)，10％（W/V）SDS，0.5％（W/V）溴酚蓝，50％（W/V）甘油，5％（W/V）β-巯基乙醇；1.2仪器与设备：恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%）、棉球、接种环、台式离心机、Tip（10μL、200μL、1mL）、微量加样器（10μL、200μL、1mL）、离心管（1.5mL）。1.3操作步骤：①将基因工程菌E.co