拟南芥基因的图位克隆技术

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拟南芥基因的图位克隆技术 拟南芥（Arabidopsisthaliana）是一种模式植物，具有基因组小（125Mbp）、生长周期短等特点，而且基因组测序已经完成（TheArabidopsisGenomicInitiative,2000）。从遗传学的观点来看，基因克隆的途径可概括为正向遗传学和反向遗传学两种。正向遗传学途径指的是通过被克隆基因的产物或表现型突变去进行反向遗传学途径则指的是依据被克隆基因在染色体上的位置来实现 图位克隆（map-basedcloning）又称定位克隆（positionalcloning），1986年首先由剑桥大学的AlanCoulson提出，用该方法分离基因是根据目的基因在染色体上的位置进行的，无需预先知道基因的DNA序列，也无需预先知道其表达产物的有关信息。它是通过分析突变位点与已知分子标记的连锁关系来确定突变表型的遗传基础。图位克隆能实现，关键在于全基因组(Col-0生态型)测序计划的完成和各种分子标记的发现。这些数据被储存在专门的数据库中（表1）。 分子标记:实现基因图位克隆的关键是筛选与目标基因连锁的分子标记。分子标记是一个特异的DNA片段或能够检出的等位基因，对其有效地利用即可达到图位克隆基因之目的。迄今为止，已有几十种技术可用于分子标记的筛选,其中最为常用的是简单序列长度多态性（SSLP）,和单核苷酸多态性（SNP）。 SSLP：简单序列长度多态是基于PCR的分子标记，在拟南芥基因组中有较多分布（在Col和Ler两个生态型中，每1000bp有4—11个不同的序列），而且是共显性的，它的检测非常直接，需要设计引物来检测假定的SSLP标记 SNP：单核苷酸多态性，它是拟南芥不同生态型之间基因组中的单个核苷酸的差别，这些差别的核苷酸通常位于不编码区域。最常见的用于检测SNP标记的方法主要是剪切（酶解）扩增多态性序列（CAPS），它也是基于PCR的。 因为有了拟南芥的基因组序列和高密度的遗传标记，图位克隆过程就变得相对直接。从基于Col-0和Ler遗传背景的突变体出发，我们有可能在大约一年时间内找出与这个突变相关的基因，作为作图过程的第一步，突变体植株将和另外一个生态型（Col-0或者Ler）的植株杂交。然后播种F1代种子。在F1代植物的生长过程中，我们就有可能来对其表现型和基因型进行分析。F1代植物的表型的出现或者消失将显示着我们所研究的突变是显性的还是隐性的。 col0诱变繁种淘汰致死突变和不能繁殖突变筛选突变体处理Landsberg野生型×确定突变体是否是单基因突变及显隐性突变体筛选 基因图位克隆aaAA×Col-0突变体Landsberg野生型F1aA×1234512345aAaAAAaaF2粗定位在大多数情况下，用于杂交的突变体植株是作为父本还是母本是没有关系的。 aaaaaaaamakerCol-0Ler单交换双交换不交换不交换重组率＝单交换＋2×双交换2×样品总数×100％Col-0LerCol-0Ler 在15个maker中，重组率最小者距目标基因最近细定位a粗定位maker细定位maker细定位maker在3个maker中，重组率最小者目标基因距该maker最近循环若干次 一般情况下能在突变两侧找到相距小于40Kb的两个分子标记。找到之后，就可以通过测序来找到突变基因。一种有效的方法是设计PCR引物来扩增覆盖这40Kb的多个重叠的500bp的片段。将这些片段测序后拼接起来以得到整个40Kb的序列，然后将它与野生型植物（Col-0或者Ler）的序列进行比对，这就可以找到这个区域中的多个基因。从一系列侯选基因中鉴定基因是定位克隆技术的最后一个关键环节。现在最常用的方法是用含有目标基因的大片段克隆如BAC克隆或YAC克隆去筛选cDNA文库，并查询生物数据信息库，待找出侯选基因后，把这些侯选基因进行下列分析以确定目标基因：（1）精确定位法检查cDNA是否与目标基因共分离；（2）检查cDNA时空表达特点是否与表型一致；（3）测定cDNA序列，查询数据库，以了解该基因的功能；（4）筛选突变体文库，找出DNA序列上的变化及与功能的关系；（5）进行功能互补实验，通过转化突变体观察突变体表型是否恢复正常或发生预期的表型变化。 存在的问题:图位克隆也有其自身的局限性，在某些情况下，就很难或者不能通过图位克隆技术来定位基因1.一个给定的性状是由不止一个的基因位点控制的2.表观（上位）遗传突变:一个基因在表达和功能上的可遗传改变，而不涉及DNA序列的改变，这是图位克隆工程中又一个可能的复杂情况3.染色体上位点的物理和遗传距离的比值变化是比较小的，对作图的分辨率也只有较小的影响,1%重组的遗传距离相当于100--400Kb的物理距离，平均是250Kb。然而着丝粒区域是一个显著的例外，在这里1%重组的遗传距离相当于1000--2500Kb。