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时间:2018-12-02
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1、人脐静脉内皮细胞分离培养的改进及其鉴定作者:张小燕梁朝赵林张威李芊崔伟光【摘要】目的改进静脉内皮细胞原代培养的方法,提高体外培养血管内皮细胞的成功率。方法采用5号带柄一次性静脉输液针灌注消化液,分别用0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化脐静脉内膜,比较三种酶液消化的结果,并在倒置相差显微镜下观察其形态特点,同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。结果0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶的最佳消化时间分别为15min,10min,12min。倒置相差显微镜下观察内皮细胞为单层生长,鹅卵石样镶嵌排列。免
2、疫组织化学检测表明细胞内有Ⅷ因子相关抗原。结论胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液,且0.1%胶原酶消化12min获得的细胞数量多,成活率高。【关键词】人脐静脉内皮细胞细胞培养分离改进Improvementofseparation,cultureandidentificationofhuman【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheprimaryculturemethodofehdothelialcellsfromhumanumbilicalvEinandimprovetherateofsucc
3、essfulcultureinvitro.Methods0.125%,0.25%trpsinand0.1%collagenaseanumbilicalvEInbyusingdisposableveintransfusionneedleNo.5,afterorphologyandimmunohistochemistryunderinvertedmicroscope.ResultsTheculturedcellshadacobblestoneappearanceonolayergroanyendothelialcellsafterdi
4、gestedby0.125%,0.25%trpsinand0.1%collagenasefor15minutes,10minutes,12minutesrespectively.ConclusionThecollagenasehumanumbilicalvein.【Keyanumbilicalveinendothelialcellscellcultureseparationimprovement血管内皮细胞具有多种生理功能,能产生和分泌许多生物活性物质,在维持血管舒缩,抗凝血等方面起重要作用。体外血管内皮细胞的成功培养是研究内皮细
5、胞功能及其在各种疾病发生发展中所起作用的基础。本文报告利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带,采用改进的灌流消化法[1]分离脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC)成功传代培养并予鉴定,方法可靠,简便易行,有利于后续实验研究的进行。1材料与方法1.1标本采集在无菌条件下取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带(长于20cm)后,去除脐带血管中的残余血液,放入含青、链霉素的磷酸盐缓冲液PBS中,6h内行脐静脉内皮细胞分离、培养。1.2试剂RPMI1640培养基(美国GIBCO公司),新生小
6、牛血清(杭州四季青生物公司),Ⅰ型胶原酶(美国GIBCO公司),胰蛋白酶(美国GIBCO公司),兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。1.3仪器Ⅱ级生物安全柜(苏净集团安泰公司),CO2培养箱(日本SANYO),倒置荧光显微镜(重庆光学仪器厂)。1.4试剂配制RPMI1640完全培养液:20%新生小牛血清,80%RPMI1640,100U/ml青霉素,100U/ml链霉素。Ⅰ型胶原酶溶液:用不含Ca2+、Mg2+的Hanks液配制,0.22μm滤膜滤过除菌,保存于-20℃。1.5人脐静脉内皮细
7、胞原代培养无菌条件下取新生儿脐带,在Ⅱ级生物安全柜内剪去钳痕、血肿、凝血块阻塞部分,分成20cm一段,采用5号带柄一次性静脉输液针吸取36℃预热双抗PBS,插入脐静脉断端,同时结扎固定针体,反复将静脉内残血冲洗干净,再用血管钳夹闭脐带另一端,然后分别注入所配制0.125%、0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶消化液,使管腔充盈,37℃,作用6、8、10、12、15、17min;松开一端血管钳,收集脐静脉内的消化液,然后注入含10%新生小牛血清的RPMI1640培养液再次冲洗管腔,以获得更多的内皮细胞;将消化液和冲洗液一并注入离心管,
8、800r/min,离心5min,弃上清,加入RPMI1640培养液,吹打均匀,制成细胞悬液,按2×105个细胞/瓶接种于25cm2一次性培养瓶中,置于37℃,5%CO2培养箱中培养。24h后更换培养液去除未贴壁细胞,然后每隔24h半定量换液一次至细
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