实验五显微镜油镜的使用细菌的革兰氏染色及芽孢染色张理珉

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1、实验五显微镜油镜的使用细菌的革兰氏染色和芽孢染色目的要求1、掌握细菌观察制片染色技术2、掌握革兰氏染色和芽孢染色的原理及方法步骤3、掌握显微镜观察技术（油镜的原理及使用）实验内容一显微镜油镜的使用及显微技术的介绍常用的度量单位单位缩写数值1厘米cm10-2m1毫米mm10-3m1微米μm10-6m1纳米nm10-9m1埃Å10-10m一、显微镜的种类光学显微镜——常规研究工作电子显微镜——研究细胞内部的、表面的结构及亚细胞结构微生物的大小情况列文·虎克及其发明的显微镜、观察到的微生物形态1676年荷兰人列文虎克用自磨

2、镜片，创造了一架能放大266倍的原始显微镜检查了污水、齿垢、粪便等，发现了许多肉眼看不见的微小生物，正确描述了微生物的形态有球形、杆状和螺旋样，为微生物的存在提供了科学依据。二、一般光学显微镜的结构组成普通光学显微镜光路及原理显微镜的数值孔径值镜口角——指从物镜光轴上的像点发出的光线与物镜前透镜有效直径的边缘所张开的角度，即形成的光锥（α：光锥角度的一半）；数值孔径和显微镜的光学性能有密切的关系，它与显微镜的分辨力成正比，与焦距成反比，与镜像亮度的平方根成正比NA=η·sinα光学显微镜物镜的特性特性物镜搜索物镜低倍镜高

3、倍镜油镜放大倍数4×10×40~45×90~100×数值孔径值0.10.250.55~0.651.25~1.4焦距（f）40mm16mm4mm1.8~2.0mm工作距离17~20mm4~8mm0.5~0.7mm0.1mm450nm光源（蓝光）时的分辨率2.3μm0.9μm0.35μm0.18μm物镜的焦距、工作距离和孔径光栏的关系油浸物镜分别在空气和浸没油为介质时的工作情况显微镜油镜的原理和使用油浸系→香柏油：η=1.52数值孔径：NA=η·sinα显微镜的分辨率：分辨两点间最小距离的能力加入香柏油的作用?油镜使用注意事

4、项?三、显微镜油镜的使用步骤利用低倍物镜找到所需要观察的材料视野（放大倍数由低到高），并利用载物台调节器（水平和垂直）将其调到视野的中央位置（有时可以省略——肉眼判断）；利用粗调旋钮降低载物台，旋转物镜转盘，使油镜（100×）转到标本上方；从侧面滴加香柏油于载玻片标本上（少量，中央）；利用粗调旋钮升高载物台，使油镜刚刚浸没于香柏油即可（用肉眼从显微镜侧面观察）；开大孔径光栏，升高聚光镜，用眼通过目镜观察，前后调节细调旋钮，直至物像清晰；观察完后，降低载物台，利用镜头纸蘸二甲苯擦拭油镜或粘到香柏油其它物镜（40×）。一般光

5、学显微镜（内置光源）的调整要求放大倍数的选择（物镜的选择，一般有4×、10×、40×、100×）光照强度（照明）的调节（灯泡电压高低的调整）聚光镜的调整（升降）——光线的会聚孔径光栏的调整（大小）——通光量瞳距调节（具体后面介绍）屈光度调节（具体后面介绍）以上各项综合调整，达到的唯一目的——物像清晰、反差强。四、光学显微镜所涉及的观察方式1.明场观察2.暗场观察（暗视野）3.相差观察（明视野）4.偏光观察5.DIC观察（微分干涉）6.RC观察（浮雕相衬）7.荧光观察1.明场观察方式常规观察方式应用领域：常规镜检、病理、染

6、色标本优点：视野亮度高、均匀，应用范围广，操作简单，价格低，物镜适用于荧光观察缺点：透明标本对比度低，标本没有立体感明场观察显微镜的调节瞳距调节屈光度调节光路转换聚光镜中心孔径光栏设置瞳距调节刻度指示屈光度调节调节屈光度调节指示光路转换100%80%20%100%聚光镜中心调节⑤光轴中心调节螺钉③视场光阑③孔径光阑②10X物镜①标本④聚光镜升降旋钮孔径光栏调节N.A聚=(0.6~0.8)N.A物和物镜配合使用孔径光栏开度与图象100%70%30%HRLCHCLRMRMC2.暗场观察（暗视野）暗视野显微镜的结构及其效果照片

7、（梅毒螺旋体和团藻属、水棉属）原理：丁道尔（Tyndall）现象，微粒对斜射光反射或衍射，增大了人眼可见性。特点：观察到极其微小物体，分辨率可达0.02~0.004um（明场0.4um）—“超显微”。缺点：只能观察到物体存在、运动和外部形态不方便调节标本要求高（灰尘、盖片、载片）应用：微小粒子、细菌形态观察、细菌计数，透明标本观察等3.相差观察（明视野）相差显微镜结构及原理图原理：利用被检物体的光程（折射率×厚度）差进行镜检，即利用干涉现象，将相位差变为人眼可以分辨的振幅差。相差显微镜效果照片（迂回螺菌、肉毒梭菌、草履虫

8、、阿米巴变形虫）特点：鉴定活体细胞最实用、最经济的方法缺点：需要光强高切片不能太厚（5~10um）盖玻片、载玻片需符合标准最好配用单色滤光镜操作较麻烦荧光效果不如明场物镜应用：无色透明活体标本的细微结构，检查,鉴定活体细胞（培养细胞，分离细胞）调节：苛勒照明调节将相差物镜及附件转入光路,对样品聚焦取下目镜，装上CT望