重组人gdnf基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达

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1、重组人GDNF基因逆转录病毒真核表达载体的构建及表达作者：陈睿刘雪平郭春红孙志军【摘要】　　目的构建含有胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和加强型绿色荧光蛋白基因（EGFP）的逆转录病毒载体,将其导入包装细胞PT67，检测基因在细胞中的表达。方法PCR法扩增GDNF基因及IRES2EGFP基因，测序验证正确后与逆转录病毒载体pLXSN连接，构建重组逆转录病毒质粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。EcoRI酶切鉴定重组质粒。脂质体Lipofectamine2000介导下转染包装细胞P

2、T67,G418筛选并检测病毒滴度。流式细胞仪和荧光显微镜分别检测转染效率和基因表达。结果PCR扩增得到大小约558bp和1308bp的特异性条带，测序证实，获得正确的人GDNF序列和EGFP序列。经EcoRI酶切鉴定，成功构建重组质粒pLXSNIRES2EGFPGDNF。荧光显微镜检测显示GDNF基因获得良好表达，流式细胞仪检测转染效率为24.4%。结论正确克隆了人GDNF基因全序列并构建重组逆转录病毒pLXSNIRES2EGFPGDNF质粒。基因转染包装细胞PT67获良好表达。【

3、关键词】胶质细胞源性神经营养因子；逆转录病毒；脂质体；基因转染　　帕金森病(PD)临床疗效不佳,有学者将骨髓间充质干细胞（MSCs）定向移植入PD鼠模型的黑质纹状体区，发现其能够存活并分化为酪氨酸羟化酶（TyrosineHydroxylase，TH）表型神经元，从而改善PD大鼠症状，但不能阻止神经细胞的进一步死亡。于是有学者探索将神经营养因子体外转染靶细胞，通过立体定向的方式移植入鼠的黑质纹状体区，发现可促进PD大鼠的黑质纹状体神经通路的结构和功能的恢复。本课题拟在以上研究的基础上，应用人胶质

4、细胞源性神经营养因子（glialcelllinederivedneurotrophicfactor,GDNF）重组逆转录病毒体外转染MSCs，立体定向移植入PD大鼠模型的黑质纹状体区，通过对相应指标的测定,分析逆转录病毒介导GDNF基因转染MSCs移植治疗PD的可行性及其疗效。本文为实验的第一部分，旨在构建一个携带有治疗基因GDNF同时携带报告基因加强型绿色荧光蛋白(enhancegreenfluorescentprotEin,EGFP)的逆转录病毒重组质粒，转染包装细胞PT67后，检测基因

5、的表达及转染效率，为下一步转染MSCs、进一步深入探讨GDNF基因在神经系统疾病基因治疗中的作用奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料、试剂和仪器　　人神经胶质细胞瘤标本,由山东省立医院神经外科提供。逆转录病毒载体pLXSN质粒、携带pIRES2EGFP基因片段的质粒、PT67、NIH3T3细胞由山东省立医院中心实验室保存并提供。PCR试剂盒、pMD18T载体试剂盒、限制性内切酶XhoI、BamHI、BglⅡ、EcoRI、T4连接酶均购自大连TAKARA公司；中量质粒抽提试剂盒购自Omeg

6、a公司；GDNF基因片段及pIRES2EGFP基因片段上、下游引物，由上海博亚生物技术有限公司合成；Lipofectamine2000、OptiMEM无血清培养基购自Invitrogen公司；G418、DMEM培养液购自Gibco公司；Polybrene购自Sigma公司。　　1.2方法　　1.2.1GDNF基因、IRES2EGFP基因的克隆及测序　　参照《分子克隆实验指南》，从人神经胶质细胞瘤组织中提取总RNA后逆转录生成cDNA。以cDNA为模板，PCR扩增GDNF基因片段。同时，以含

7、有IrES2序列及EGFP基因片段的质粒为模板，PCR扩增EGFP基因片段。扩增程序：94℃5min；94℃30s，65℃30s，72℃1min，10个循环；94℃30s，55℃30s，72℃1min，20个循环；72℃7min充分延伸；4℃,保持。GDNF基因引物序列（上游5′TACTCGAGATGAAGTTATGGGATGTCGTGG3′，下游5′CGAGATCTTCAGATACATCCACACCTTTTAGC3′）；IRES2EGFP基因引物序列（上游5′TTATCTCGAGA

8、TTAAGATCTTCCGCCCCTCTCCCTCCCCCCC3′，下游5′CGGGATCCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3′）。引物设计时分别引入XhoI、BamHI、BgⅢ酶切位点。扩增产物纯化回收后克隆入T载体，筛选阳性克隆，使用测序仪进行测序。　　1.2.2pLXSNIRES2EGFPGDNF重组体的构建及鉴定　　XhoI和BamHI分别双酶切pLXSN质粒及pIRES2EGFP，T4连接酶连接酶切后产物，得到pLXSNIRES2EGFP；XhoI和Bgl