结核分枝杆菌hsp 65亚单位疫苗和基因疫苗的构建及免疫学特性

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1、结核分枝杆菌HSP65亚单位疫苗和基因疫苗的构建及免疫学特性作者：席丽，师长宏，靳亚平，张海，张廷芬，赵勇，岳晨莉【摘要】目的：构建HSP65蛋白的亚单位疫苗和基因疫苗，并与BCG相比较，评价这两种疫苗在小鼠体内的免疫学特性.方法:从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出hsp65基因，连接进入pMD18T载体中，测序后，利用不同酶切位点将完整的hsp65基因分别克隆到pProEXHTb原核表达载体和pcDNA3.1(-)真核表达载体，前者在大肠杆菌中诱导表达，经SDSPAGE和TT测定脾淋巴细胞特异性增殖指数.结果：获得的结核分枝杆

2、菌hsp65基因序列与GenBank公布的完全一致；r约65000处有与鼠抗HSP65mAb和临床结核患者血清的特异性结合带；免疫荧光结果显示转染重组质粒的P815细胞的表达蛋白与HSP65mAb有特异性结合.两种疫苗免疫小鼠体内产生特异性抗体，经蛋白刺激后可引起脾淋巴细胞特异性增殖.结论：所构建的两种疫苗能引起免疫动物的特异性体液和细胞免疫反应，应进一步研究其抵抗结核分支杆菌感染的保护力机制，以用于结核病的防治研究.【关键词】结核分枝杆菌；热休克蛋白质类；亚单位疫苗；基因疫苗　　【Abstract】AIM:Toconstructthe

3、subunitvaccineandDNAvaccinebasedonheatshockprotEin65(HSP65)ofM.tuberculosisH37Rv(MTB)andtoevaluatetheimmunologicalproperties.METHODS:Thegeneofhsp65plifiedfromDNAgenomeofMTBH37Rvstrainbypolymerasechainreaction(PCR).ThePCRproductenteronoclonalantibodyagainstMTBHSP65andsera

4、fromclinicalTBpatients.Rebinant6×Hisfusedprotein;theeukaryoticrebinantplasmidmunofluorescenttechnology.RESULTS:ThesequenceofPCRproductolecularmassidentifiedbySDSPAGEanalysisedbyTBHSP65andTBpatientssera,andtheremunologicalproperties.Itycobacteriumtuberculosis(MTB);heats

5、hockproteins;subunitvaccine;DNAvaccine　　0引言　　结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（MTB)引起，经呼吸道传播的慢性传染病.卡介苗(BCG)接种是预防TB的主要手段，但其预防效果不稳［1］.热休克蛋白65(HSP65)是热休克蛋白60家族成员之一，由groEL2基因编码,是一种高度保守的蛋白质［2］.在结核杆菌感染过程中，HSP65是机体对抗其入侵的重要的免疫保护性抗原之一，该蛋白具有很强的免疫原性［3］，Yang等［4］发现在MTB感染小鼠化学治疗后接种HSP65DNA，

6、能够清除残余细菌，提示HSP65抗原不仅可作为预防性疫苗的候选组分，也可作为治疗性疫苗的候选组分.我们运用分子生物学技术分别构建了MTBHSP65蛋白亚单位疫苗和DNA疫苗，并在小鼠模型上对这两种疫苗免疫学特性进行研究，为TB新型疫苗的研究提供了一定的理论和物质基础.　　1材料和方法　　1.1材料E.coliDH5a由本实验动物中心保存，MTBH37Rv株由陕西省结核病防治研究所王瑞副主任技师惠赠.克隆载体pMD18T质粒购自TaKaRa公司，原核表达质粒载体pProEXHTb和真核表达载体pcDNA3.1(-)质粒均购自Promeg

7、a公司.LATaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，限制性内切酶EcoRⅠ，EcoRⅤ，HindIII及DNA标记物DL2000购自大连TaKaRa公司.质粒抽提试剂盒购自BBI公司，辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)标记的羊抗鼠IgG和羊抗人IgG购自武汉博士德公司，鼠抗MTBHSP65mAb购自北京博菲康公司.纯化的HSP65蛋白由本实验室制备，含有Ni+鳌合剂的NiNTA纯化试剂盒购自Invitrogen公司.　　1.2方法　　1.2.1目的基因的扩增与克隆①目的基因的扩增：按参考　　图2原核表达

8、重组质粒和真核表达重组质粒酶切鉴定（略）　　M:蛋白marker；1,5:DH5α中未诱导的重组质粒pProHSP65的表达产物；2～4:DH5α中诱导的重组质粒pProHSP65的表达产物；6:DH5