糖尿病大鼠膀胱超微结构改变及毒蕈碱受体基因表达的研究论文

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1、糖尿病大鼠膀胱超微结构改变及毒蕈碱受体基因表达的研究论文黄启敏，李宏，黄达飞，周青英【摘要】目的：研究病程3周的2型糖尿病（DM）大鼠膀胱超微结构改变以及毒蕈碱型受体基因表达改变。方法：2日龄雌性所致膀胱病理改变.freelellius，DM）引发的自主神经病变而所致的神经源性膀胱是泌尿外科临床上最为棘手的难题之一。与排尿生理活动密切有关的两个因素是膀胱尿道的肌肉与其支配的神经系统，以往的研究主要集中在原发的病理改变与水平（即神经系统病变的定性与定位）方面，而对排尿障碍时受累终末器官——膀胱的功能缺陷研究不多。有学者在研究链脲佐菌素(ST

2、Z)诱导的大鼠DM对于排尿功能的急性影响时发现，排尿功能障碍是逐渐出现的。所以，本实验选取病程3周的2型DM大鼠作为研究对象，深入研究糖尿病性膀胱超微结构改变以及毒蕈碱型受体（Muscarinicreceptor，M受体）基因表达改变，为预防、治疗DM所致膀胱病理改变，解决DM性神经源性膀胱这一临床难题提供科学依据。1材料和方法1.1动物模型与分组新生雌性组，每组15只。DM大鼠：STZ溶于0.1mol/L枸橼酸缓冲液(pH=7.4)配成200g/L溶液，按90mg/kg体重剂量腹腔注射1次，待4周龄断乳时再以200g/LSTZ25～30

3、mg/kg体重腹腔注射追加1次，并以高糖高脂饮食(18%猪油，20%蔗糖，3%蛋黄粉，59%基本饲料)饲喂。8周龄时以空腹尾静脉血糖浓度11.1mmol/L为造模成功。正常对照组：注射相同剂量的枸橼酸缓冲液。两组均自由进食进水。于DM病程第4周时进行实验。1.2离体全膀胱制备腹腔注射戊巴比妥30mg/kg体重，麻醉后以仰卧位固定大鼠，取下腹正中切口暴露膀胱，切除膀胱称湿重1。切取膀胱体部立即置于液氮保存。切取膀胱全层组织，以10%甲醛固定，浸蜡，包埋切片，予常规苏木精-伊红染色，于40～400倍光镜下观察，测定膀胱壁厚度。取大鼠膀胱肌肉组

4、织，取1mm×1mm×1mm置于4%戊二醛溶液低温固定，包埋、切片、锇酸染色定位后超微切片，于1～1.5万倍透射电镜下观察。1.3RT-PCR法检测M3受体mRNA表达水平按照说明书方法(上海生工产品)提取总RNA，取100mg组织剪碎后加入80μLTrizol试剂，-20℃过夜。加200μL氯仿剧烈振荡混匀，12000r/min室温离心5min，取上清。加等体积异丙醇，12000r/min室温离心5min，取沉淀即为细胞总RNA。以70%酒精精洗涤2次，12000r/min室温离心2min，RNA沉淀于室温下自然干燥，使酒精完全挥发。分

5、光光度法测定RNA纯度及浓度后，取2μg应用MMLV第一链cDNA合成试剂盒(上海生工产品)进行逆转录反应合成第一链cDNA。取总RNA模板2μg、引物Oligo(dT)18(0.5g/L)1μL，用Rnase-freeddH2O定容至12μL，混匀，70℃水浴5min。加入5×ReactionBuffer4μL、RNaseInhibitor(20kU/L)1μL、dNTPMix(10mmol/L)2μL混匀，37℃水浴5min。加入1μLM-MuLVRT(20kU/L)，终体积为20μL。37℃水浴60min，70℃加热10min结束反

6、应，-20℃冻存。应用Primer3.0软件进行引物设计。选用3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内参照。按照高保真即用聚合酶链反应(PCR)扩增试剂盒(上海生工产品)说明书进行PCR扩增反应。反应体系为：2×HiFi-PCRMaster2.5μL、SterialddH2O8μL、12.5μmol/L引物各1μL、10μg/L第一链cDNA2.5μL，总体积为25μL。反应条件为：94℃，5min；94℃，40s；60℃，40s；72℃，40s(40个循环)；72℃，10min。PCR扩增产物在1.6%的琼脂糖凝胶中100V恒压电泳约30

7、min后，用复日FR-980生物凝胶电泳图像分析系统对电泳带成像并进行图像分析，测定其灰度值并计算M3受体与GAPDH标准的mRNA浓度比值用于定量比较。1.4统计学处理方法采用t检验。2结果2.1DM大鼠膀胱病理改变DM大鼠均建模成功。相对于正常大鼠，DM大鼠膀胱壁结构光镜下可见肌细胞肥大，形态多样，肌纤维排列紊乱，间质纤维组织及胶原增生，黏膜下层有明显嗜酸性粒细胞浸润，肌层有轻度黏液样变性；膀胱肌层电镜下有明显的肌细胞核固缩、细胞器空洞样变、细胞连接纤维化、成纤维细胞变性及胶原纤维排列紊乱。2.2RT-PCR法检测M3受体mRNA表达

8、水平病程4周时DM组大鼠膀胱逼尿肌M3受体mRNA的数量为(58.0±6.2)%，显著高于正常对照组的(34.8±9.8)%(P0.05)。3讨论目前研究已证实，在鼠、猫、犬及人类的膀胱体与底