糖尿病大鼠逼尿肌线粒体超微结构及基质的改变

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1、糖尿病大鼠逼尿肌线粒体超微结构及基质的改变双卫兵，王东文，张炜芳，吴博威【关键词】糖尿病　Anexperimentalstudyofultrastructuralchangeofmitochondrionofdetrusorindiabetesrats　　ABSTRACT:ObjectiveToobservetheultrastructuralchangesofdetrusorinexperimentalT2DMrats.Methods14)大鼠逼尿肌细胞线粒体超微结构的改变。方法建立T2DM大鼠动物模型,利用透

2、射电镜观察其逼尿肌细胞内线粒体结构并应用BI2000序列图像分析软件检测线粒体密度。结果对照组的线粒体相对光密度为2.417±0.376,相对灰度为0.572±0.083；T2DM组逼尿肌细胞内线粒体相对光密度为1.549±0.871,相对灰度为0.836±0.279，线粒体基质密度较正常明显下降。结论糖尿病大鼠逼尿肌细胞内线粒体超微结构破坏,基质密度下降,提示逼尿肌细胞能量代谢障碍是糖尿病膀胱收缩力降低的原因。　　关键词：膀胱；线粒体；糖尿病；逼尿肌　　糖尿病引起膀胱功能障碍最常见的症状是膀胱感觉功能障碍，残余

3、尿增多，排尿期逼尿肌收缩力减弱[1]，尤其在晚期更为明显，严重影响患者的生活质量。而糖尿病膀胱尿道功能障碍的具体发病机制目前还不清楚。近期研究表明上述的功能变化存在着神经性、血管源性和肌源性的因素，肌源性因素正日益受到人们的重视。我们建立2型糖尿病(T2DM)大鼠模型,在了解逼尿肌功能变化的基础上,进一步观察逼尿肌细胞线粒体超微结构的变化，以探讨其功能变化的细胞生物学基础。　　1材料与方法　　1.1T2DM大鼠模型的建立[2]及实验分组　　清洁级近交系4周龄雌性组和对照组。链脲佐菌素(strepozotocin,

4、STZ)溶于pH4.4，浓度为0.1mol/L枸橼酸缓冲液中，T2DM组大鼠按30mg/kg体质量的剂量腹腔内注射STZ，每日1次，连续3次；在末次注射2周后,改喂高糖高脂饮食(18%猪油，20%蔗糖，3%蛋黄，59%普通饲料)。高糖高脂饮食喂养第3周测定血糖及胰岛素，挑选空腹血糖大于对照正常大鼠空腹血糖均值+3个标准差，胰岛素敏感性降低者确定为T2DM大鼠纳入实验。对照组给普通饲料，腹腔内注射等体积的枸橼酸缓冲液。实验第14周分别取T2DM组及对照组动物各9只，制备逼尿肌标本进行电镜观测。　　1.2标本制备　　

5、处死大鼠后立即切取膀胱，取膀胱体部逼尿肌组织，去除黏膜层及浆膜层，将逼尿肌组织切成1mm3小块，加预冷的2.5%戊二醛-2%的多聚甲醛混合固定液2mL，于4℃下固定2h，再用磷酸缓冲液冲洗后，用1%锇酸固定1.5h，逐级脱水，再用70%酒精饱和醋酸铀块染8-10h，用环氧树脂618包埋，于60℃下聚合48h，用瑞典LKB型超薄切片机制成厚约50nm的切片，置于铜制切片载网上干燥保存。　　1.3线粒体结构观察和灰度测定　　应用JEM100CX型透射电子显微镜,放大15×103倍观察线粒体。每只实验鼠选取逼尿肌为纵行

6、走向、靠近逼尿肌细胞核的6个视野摄片，图片用BI2000序列图像分析软件测定每个视野中线粒体的平均光密度和平均灰度。为避免各个视野在成像时由于曝光时间不同造成的密度差别,同时在线粒体周围圈取细胞胞质测定胞质平均光密度和平均灰度。将线粒体平均光密度与周围胞质的平均光密度的比值定义为该线粒体相对光密度,将线粒体平均灰度与周围胞质的平均灰度之比值定义为该线粒体相对灰度[3]。　　1.4统计学处理　　分别计算T2DM组和对照组逼尿肌线粒体相对光密度和相对灰度值的均数和标准差,应用SPSS11.0统计软件进行t检验，α=0

7、.05。　　2结果　　2.1两组间线粒体形态的比较　　T2DM组逼尿肌细胞中线粒体呈现不同程度的肿胀，基质密度降低，线粒体嵴断裂、变短、稀疏、消失，部分线粒体甚至可呈空泡状(图1A)。对照组线粒体基质致密，线粒体嵴清晰，完整(图1B)。　　2.2两组间线粒体基质相对光密度及相对灰度的比较　　图像分析软件将灰度最高值定义为0,灰度最低值定义为255。线粒体相对光密度和相对灰度均可反映线粒体基质的密度情况，而线粒体基质密度减低程度可以作为线粒体肿胀的定量指标。与对照组相比，T2DM组线粒体基质平均相对光密度显著降低，

8、而平均相对灰度显著增高(P0.05，表1)。表1两组线粒体基质图象分析结果(略)　　3讨论　　在临床尿动力学检查中我们发现糖尿病病人逼尿肌收缩力减弱或无反射较为常见，表现为尿流率低，残余尿增多，大鼠逼尿肌细胞线粒体中某些三羧酸循环的关键酶(限速酶)活性显著下降(另文刊出),可见在糖尿病神经源性膀胱的发病过程中直接影响到了膀胱逼尿肌细胞的能量代谢。线粒体破坏导致的逼尿肌能量