dc与cik共培养对肝癌细胞杀伤活性的研究论文

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1、DC与CIK共培养对肝癌细胞杀伤活性的研究论文.freelaCellsAbstractThisstudyedtoinvestigatetheproliferationactivitiesandphenotypechangesofDC，CIKandDC-CIK，andtheircytotoxicityagainsthepatocarcinomacellsinco-cultureofDCononuclearcells(PBMNC)heathyadultdonors.AfterincubationofPBMNCfor2

2、hours，DCsadherentcellsbysomecytokinesandCIKsnon-adherentcells.MatureDCsacelllineacellsatloacellline，munecells.Keymunetherapy近年来随着细胞免疫学和分子生物学的发展，恶性肿瘤的细胞免疫治疗已经开始在临床应用，并取得一定疗效。细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokineinducedkillercell，CIK）是一种高效、新型免疫活性细胞，是恶性肿瘤过继免疫治疗的重要手段之一。树突状细胞（dend

3、riticcells，DC）是目前发现的功能最强的抗原呈递细胞（APC），它通过处理、呈递抗原，介导机体免疫应答。由于许多肿瘤宿主缺乏功能性DC而不能诱发抗原特异性T细胞应答，故在体外诱导功能性DC用于主动免疫治疗具有重要的临床应用价值。本实验将成熟DC和CIK细胞共培养，观察DC-CIK细胞群的增殖活性和表型变化，及其对肝癌细胞的体外杀伤作用。材料和方法主要试剂和仪器IMDM完全培养基为Gibco公司产品，10%AB灭活血清为南京红十字血液中心产品，AIM-V无血清培养基为Gibco公司产品，淋巴细胞分离液购自

4、上海第二制药厂，CD3单克隆抗体购自OrthoBiotech公司，IFN-α1b购自上海生物制品研究所，rhIL-2购自Chiron公司，rhGM-CSF，rhIL-1β，rhIL-4，rhIL-6，TNF-α和PGE-2均购自PEPROTech公司，MTT购自R＆DSystems公司）。正常人外周血取于4名健康供者。肝癌细胞株SMMC-7721为本实验室液氮保存株。流式细胞仪为美国BectonDickinson公司产品，透射电镜为HITACHI公司产品。CIK细胞的体外诱导和扩增通过血细胞分离机从健康供者采集外

5、周血单个核细胞（MNC），用淋巴细胞分离液（Ficoll）分离出MNC，用AIM-V无血清培养基调细胞浓度为（4-6）×106/ml，置于37℃、5%CO2培养箱培养2小时。收集非贴壁细胞，用含10%人AB血清的IMDM调细胞浓度为（1-2）×106/ml，并加入1000U/ml的IFN-α悬浮培养，24小时后加入1μg/ml的CD3单克隆抗体和1000U/ml的rhIL-2，每隔3天半量换液1次，补充rhIL-2，调整细胞浓度始终为（1-2）×106/ml。DC的体外培养在PBMNC培养2小时之后的贴壁细胞中，

6、加入含1000U/ml的GM-CSF和1000U/ml的IL-4的AIM-V培养液，37℃、5%CO2培养箱培养。每3天换液1次并补充细胞因子，第6天加入上述细胞因子的同时还加入IL-1β、TNF-α、PGE-2等细胞因子诱导DC成熟，共培养8-9天。DC与CIK细胞共培养收获的DC计数后和CIK按1∶5混合培养，共培养3天。CIK及DC-CIK对肿瘤细胞的细胞毒作用的MTT测定以培养12天的CIK、DC-CIK共培养物作为效应细胞，SMMC-7721肝癌细胞株为靶细胞。取对数生长期7721肝癌细胞，调整浓度为1

7、×105/ml，CIK、DC-CIK的细胞浓度分别调整为2.5×105/ml、5×105/ml、1×106/ml、2×106/ml，效靶比依次为为2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1，实验分3组，每组3个复孔，实验组加效、靶细胞各100μl/）检测吸光度（A），计算杀伤率。计算公式为：杀伤率=［1-（A实验孔-A效应孔/A靶细胞孔）］×100%CIK、DC、DC-CIK细胞群表型检测在DC培养的第9天用流式细胞仪进行免疫表型分析，在CIK细胞培养的第9、14、21天分别取少量细胞进行流式细胞术测定，DC-CIK

8、共培养物共培养3天后进行流式细胞术测定。DC透射电镜观察将诱导培养至第9天的DC收获，取1×106个细胞悬液，离心，细胞沉淀用2.5%戊二醛及1.0%的锇酸固定，经乙醇梯度脱水，超薄切片铅铀染色后置透射电镜下观察。统计学处理采用SAS软件进行t检验。结果细胞的增殖情况及形态观察CIK和DC-CIK的增殖活性培养细胞在第3天开始出现增殖，第5天以后进入快速增殖期。DC-CI