肠道致病菌多重pcr快速检测体系研究论文

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1、肠道致病菌多重PCR快速检测体系研究论文沙门菌属、志贺菌属、侵袭性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌是常见的引起人类和动物细菌性痢疾和细菌性食物中毒的肠道致病菌，严重的危害着人类健康和牲畜的安全〔1〕。因此，建立一种快速、简便、准确、特异地检测方法具有重要意义。目前常见病原菌的检验方法存在着检测周期长、工作量大、所需试剂多，而且假阴性率高，灵敏度低，或假阳性率高，特异性差等缺点。PCR技术提供了理想的检测方法。本实验采用多重PCR方法，可在同一反应体系中检测不同的细菌.freell,置于Eppendorf管中,8000r／min，灭菌蒸馏水洗涤2次,最后用1ml蒸馏水悬浮

2、,隔水煮沸10min,8000r／min，离心10min,取上清,即为DNA模板溶液。143多重PCR扩增条件的优化通过多次试验先确定了变化较小的因素buffer,dNTP,再对影响较大的因素如MgCl2浓度、引物浓度、Taq酶用量、模板浓度，在1个范围内做正交实验，再进行局部微调，最后调整退火温度和循环数参数等。取PCR产物5μl及DNAMarker参照物在含有(GV)的1%琼脂糖凝胶中电泳，电压75V,电泳40min后在紫外灯下观察结果。144多重PCR体系的特异性、灵敏度、样品检测(1)特异性检测：9株标准目的菌株和7株非目的菌株,提取DNA模板,.fr

3、eelol/L）,Taq聚合酶08μl(5U/μl),dNTPs2μl（10mmol/L）,粗提DNA模板各1μl。扩增条件:94℃预变性4min,94℃变性45s,退火58℃40s,延伸72℃60s,32个循环，最后72℃保温5min，见图1。1：肠炎沙门菌；2：阿柏丁沙门菌；3：鸡雏沙门菌；4：德尔比沙门菌；5：鼠伤寒沙门菌；6：产毒素大肠埃希菌C83902；7：产毒素大肠埃希菌C83902；8：福氏志贺2a；9：福氏志贺2b；10：宋氏志贺；11：侵袭性大肠埃希菌；12：肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌；13：产毒素大肠埃希菌+福氏志贺2a；14：肠炎沙门菌+福氏

4、志贺2a；15：福氏志贺2a+肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌；16：肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌+福氏志贺2a；17：肠炎沙门菌+产毒素大肠埃希菌+福氏志贺2a图1多重PCR反应检测结果（略）22特异性用所建立的方法检测沙门菌、志贺菌属、侵袭性大肠埃希菌、肠产毒素大肠埃希菌均扩增出特异的、与预期结果相符的DNA片段,未见非特异性扩增带，且其他的非目的菌株未扩增出条带。23灵敏度单独及多重PCR体系中几种菌的灵敏度均达到10-8fg/μl,两体系灵敏度一致,即沙门菌属为913×10-8fg/μl，志贺菌属（侵袭性大肠埃希菌）为723×10-8fg/μl，肠产毒素大

5、肠埃希菌234×10-8fg/μl，见图2。M：DNAMarker；1～4：各模板DNA稀释度分别为10-1，10-2，10-3，10-4倍图2多重PCR反应灵敏度检测结果（略）24牛肉中志贺菌的检测用多重PCR方法从牛肉中共检测出9个阳性样品。经国家标准卫生检验方法验证均为阳性〔7〕。25试剂盒稳定性和重复性除Taq酶,PCR反应液,阴、阳性模板置-20℃贮存外,其余试剂均4℃条件下贮存。在贮存时间为30，60，90，120，150，180，210，240，270和300d时取出,用已知PCR阳性样品检测试剂盒的稳定性,结果直到300d,样品PCR仍呈阳性,说

6、明该试剂盒的有效期在300d以上。此外,PCR阳性样品用试剂盒重复试验3次,结果均为阳性;而PCR阴性样品重复试验3次,均为阴性。说明该试剂盒的重复性好。3讨论本研究在于应用多重PCR快速检测肠道致病菌，考虑到引物间的配对、引物间的竞争性扩增、退火温度等均可影响多重PCR的扩增效果〔8〕，因此，查找的序列均具有很强的保守性，设计的3对引物之间不能相互配对，形成二聚体或发夹结构，Tm值基本一致等。对选取的目的菌株和非目的菌株同时进行PCR扩增,结果目的菌株均显示出特异扩增,而所有非目的菌株均不出现扩增条带,说明引物具有很强的特异性。多重PCR影响因素复杂,不同的引物、模

7、板、引物浓度、模板浓度、Mg2+浓度、dNTP浓度及其比例、缓冲液成分与浓度、反应体系、循环参数等会产生复杂的综合效应〔９〕。本体系中10×buffer,dNTPs,模板量等对多重扩增的影响不大,Taq酶、引物、Mg2+浓度、循环次数、退火温度等对PCR反应的特异性和反应效率影响较大。通过优化PCR反应体系和条件,使实验效果达到了最佳，且几种细菌随机组合的扩增也获成功,未出现相互间强抑制现象。PCR试剂盒的稳定性和重复性试验表明,该试剂盒重复性好,有效期长,特异性强，灵敏度高，结果准确,对待检样品要求不高,检测时间更短等。通过对牛肉样品的检测,显示P