多西紫杉醇诱导人乳腺癌mcf7细胞凋亡及相关基因表达的影响论文

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1、多西紫杉醇诱导人乳腺癌MCF7细胞凋亡及相关基因表达的影响论文俞乔，高佳希，何晓松，周晓明，戴美红，俞军【摘要】目的探讨多西紫杉醇(docetaxcel)诱导体外培养人乳腺癌MCF7细胞凋亡的作用及凋亡的分子机制。方法通过MTT比色法分析多西紫杉醇对人乳腺癌MCF7细胞增殖的影响；应用光镜、电镜观察细胞形态学的改变；AnnexinV/PI双染流式细胞术检测肿瘤细胞周期动力学和凋亡诱导率的影响；免疫组化方法检测凋亡相关基因bax、bc12的表达变化。结果多西紫杉醇可明显抑制人乳腺癌MCF7细胞的增殖，并

2、可导致其形态学的改变；随着加药时间的增长，G2/M期细胞增多.freelg/支，0.9%无菌生理盐水配成所需浓度。1.2细胞株人乳腺癌细胞MCF7由中科院上海细胞生物学研究所细胞库提供。用含10%的小牛血清（杭州四季青生物工程公司）的1640培养基(美国GIBCO公司),37℃，5%CO2培养箱中培养传代。1.3实验方法1.3.1多西紫杉醇对乳腺癌细胞株MCF7的增殖作用研究（四甲基偶氮唑盐MTT比色法）取对数生长期细胞用0.02%EDTA消化制成2×104/100μl细胞悬液。接种于96孔板，100μl/孔

3、，置37℃，5％CO2培养箱孵育过夜。给予相应浓度多西紫杉醇，对照组加入相同体积的培养基。ELx800通用型酶标仪（美国BioTek公司）570nm处检测OD值。抑制率计算如下：抑制率%=1-加药组细胞平均吸光值对照组细胞平均吸光值×100%1.3.2多西紫杉醇对MCF7细胞形态学及超微结构的影响细胞经0.02%EDTA消化后，制成细胞悬液1×106/ml，贴壁后加多西紫杉醇1.2μM，作用48h后，光镜下观察（×40）。收集细胞，电镜观测。1.3.3多西紫杉醇对MCF7细胞凋亡率及细胞周期变化的影响将处于对

4、数生长期的细胞，调成1×106/ml，待细胞贴壁后，加入多西紫杉醇1.2μM，对照组不加药，分别于24h、48h、72h收集细胞，用碘化丙啶（PI）进行DNA染色，用流式细胞仪（美国BectonDickinson公司）进行DNA含量分析和细胞周期分析，分析软件为MODFIT和CELLQUEST。1.3.4AnnexinV/PI双染流式细胞术检测多西紫杉醇对MCF7的诱导凋亡作用加药24h、48h后收集细胞，依AnnexinVFITCKit（bender公司）操作，取出195μl细胞悬液加入5μlAnnexi

5、nVFITC混匀并且室温放置10min。用PBS清洗细胞并重新悬浮于190μl以配好的结合缓冲液中。加10μl的20μg/ml的PI，流式细胞仪检测早期细胞凋亡情况。1.3.5免疫组化检测多西紫杉醇对MCF7细胞bax、bc12基因蛋白表达的影响将1×106细胞接种于25ml细胞培养瓶中，待细胞完全贴壁后,加多西紫杉醇1.2μM，作用48h后，收集细胞，涂片，4℃纯丙酮固定，然后分别加入抗bax、bc12抗体，室温下孵育60min或4℃过夜；生物素标记的二抗，37℃孵育60min，DBA溶液显色后，苏木素

6、复染，中性树胶封固，镜检。阳性判断：bax、bc12基因产物以胞浆和/或胞膜着咖啡色为阳性细胞。2结果2.1多西紫杉醇对MCF7细胞生长的抑制作用采用MTT法，研究多西紫杉醇对体外培养人乳腺癌MCF7细胞的生长抑制作用，绘制其生长抑制曲线，经线性回归得到，药物作用48h，多西紫杉醇对MCF7细胞的IC50为1.20±0.20μM，表明多西紫杉醇对人乳腺癌细胞株MCF7有生长抑制作用，并呈现明显的量效关系，见图1。2.2多西紫杉醇对MCF7细胞形态学及超微结构的影响光镜研究结果表明，人乳腺癌细胞MCF

7、7经多西紫杉醇作用48h后，给药组出现明显改变，癌细胞变圆，坏死，生长缓慢。对照组细胞呈上皮性生长迅速，细胞轮廓清楚，见图2。电镜下观察到,对图1多西紫杉醇对MCF7细胞的抑制作用照组：细胞核大,形状不规则,常染色,质丰富,核仁大而明显,见多个核仁。药物作用后,.freelurroF,GonellaR,etal.Dosedensevinorelbineandpaclitaxelulatingfactorinmetastaticbreastcancerpatients:antitumoractivityand

8、peripheralbloodprogenitorcellmobilizationcapabilityJ.BreastCancerResTreat，2003，82(3)：185190.2TierstenAD,NelsenC,TalbotSL，etal.AphaseIItrialofdocetaxelandestramustineinpatientsetastaticbr