巨细胞病毒抗原分支肽的合成与鉴定

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1、巨细胞病毒抗原分支肽的合成与鉴定作者：杨赛，刘陶，杨浩，韩锋产，陈五岭【关键词】人巨细胞病毒SynthesisandidentificationofCMVbranchedpeptide　　【Abstract】AIM:Toinvestigatethesynthesisofhumancytomegalovirusantigenicbranchedpeptide.METHODS:Thelinearpeptideandbranchedmultiplepeptideancytomegalovirusantigenicepitop

2、eistryrespectivelyandpurifiedbyHPLC.Thetolecularmassesassspectrumandthenidentifieds.RESULTS:Themolecularmassofthelinearpeptideultipleantigenicpeptideolecularmass.ThebranchedpeptidedifferentiatedqualitycontrolserumsproperlythroughELISA.CONCLUSION:Thesynthesisofcy

3、tomegalovirusantigenicbranchedpeptidegreatlyfacilitatesthepreviousancytomegalovirusantigenandhastheadvantageofloancytomegalovirus;Branchedmultipleantigenicpeptide　　【摘要】目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）抗原分支肽人工合成方法.方法：用固相合成方法分别合成HCMV抗原表位的线性多肽和分支多抗原肽，经HPLC进行纯化后质谱检验其分子质量，并用质控血清鉴定抗原

4、活性.结果：合成的线性肽分子质量为793.87ku，八分支肽的分子质量为7127.77ku，均与其理论分子质量相符，分支肽经ELISA初步鉴定对质控血清具有较好的分辨效果.结论：HCMV抗原分支肽的人工合成大大简化了以往HCMV抗原的制备方法，且制备成本低，无潜在生物危害.　　【关键词】固相合成；人巨细胞病毒；分支多抗原肽　　0引言　　人巨细胞病毒（humancytomegalovirus,HCMV）为已知最大的人疱疹病毒，能通过唾液、性接触、胎盘、哺乳、输血以及器官或干细胞移植等方式感染人类，引起多种疾病［1，2］.

5、HCMV在发达国家的感染率约为30%～70%，在发展中国家则达到了90％以上［3］.目前，诊断HCMV感染的主要手段为血清学检测法，检测患者血清中抗HCMVIgG，IgM.我们根据Nejatollahi等［4］以及KyteDoolittle亲水性方案预测B细胞表位结果，设计合成了含有HCMVgp55上的VTSGSTKD（aa798to805）抗原表位的八分支肽和线性肽，并用质控血清对肽的活性进行了初步鉴定.　　1材料和方法　　1.1材料　　制备型HPLC（Beckman公司）；C18反相色谱柱（25mm×100mm，1

6、5μm）（erck公司）;1氧3双二甲胺羰基苯骈三氮唑四氟化硼盐（TBTU）、1羟基苯并三氮唑（HOBT）（ABI公司）；线性多聚赖氨酸、DIEA、三氟乙酸（TFA）（Sigma公司）；G10，G25凝胶（Pharmacia公司）；乙腈（Fisher公司）；ELISA微孔板、小牛血清白蛋白（BSA）、羊抗人酶标抗体、邻苯二胺（OPD）（华美公司）；ELISA包被缓冲液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）;洗涤液为含有0.5mL/LTol/L的PBS（pH7.4）；稀释液为含50mL/L小牛血清的PBST20.

7、HCMV质控血清为第四军医大学全军基因诊断技术研究所提供.　　1.2方法　　1.2.1线性肽的合成将PACPEGPS树脂0.5g（替代度0.2mmol/g）用NN二甲基甲酰胺（DMF）浸泡30min进行活化.采用对称酸酐法将已经活化的树脂进行第一个氨基酸的连接.称取待连接的氨基酸195mg，加入1.5mL二氯甲烷（DCM）和3滴DMF使之溶解，加入1mol/L二环己基碳化二亚胺（DCC）/N甲基吡咯烷酮（NMP）275mL，磁力搅拌，室温下反应15min，反应完毕，过滤除去沉淀，蒸发掉过滤液中的溶剂，得到对称酐.将得到

8、的对称酐溶于最少量的DMF中（保证最大浓度），加入到活化的树脂中，摇动1min，然后加入0.1mol/L4二甲氨基吡啶（DMAP）/DMF460μL，摇动反应90min，吹去反应液，用10mLDMF洗涤3次，吹干.　　其余7个氨基酸的连接采用原位活化法，将连接有第一个氨基酸的树脂放入反应瓶中，加入300mL/L哌啶/DMF溶液50