fasl反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸 的实验研究论文

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1、FasL反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸的实验研究论文张娇刘倩王杰毛海婷【摘要】目的：研究FasL反义寡核苷酸对肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸的逆转作用。方法：用流式细胞术检测肝癌细胞系HepG2.2.15细胞表面Fas、FasL的表达及Jurkat细胞表面Fas的表达；用HepG2.2.15细胞与Jurkat细胞共培养方法，研究FasL诱导T细胞凋亡的功能；用脂质体介导法转导FasL反义寡核苷酸入肝癌细胞，并通过检测细胞表面FasL表达、RTPCR及细胞共培养方法研究FasL反义寡核苷酸转导对肝癌细胞免疫抑制的逆转作用。结果：①HepG2.2.15细胞低表达Fas，

2、却表达有功能的FasL，与高表达Fas的Jurkat细胞共培养可诱导后者凋亡；②肝癌细胞转入FasL反义寡核苷酸后，FasLmRNA降低；细胞表面FasL表达下降；与Jurkat细胞共培养，Jurkat细胞的凋亡率下降。结论：肝癌细胞表达的FasL可抑制T细胞的免疫功能，是肝癌细胞免疫逃逸的重要机制之一；FasL反义寡核苷酸转导可以逆转肝癌细胞的免疫抑制作用。【关键词】肝肿瘤Fas/FasL免疫逃逸寡核苷酸类.freelmuneescapeinhepatocarcinomacellline【ABSTRACT】Objective:Toinvestigatethereverse

3、actionofFasLantisenseoligonucleotideontheimmuneescapethroughFas/FasLpathacells.Methods:Fas、FasLexpressionofhepatocarcinomacelllineHepG2.2.15andFasexpressionofJurkatcellinedbyfloetry.FasLfunctionofinducingTlymphocytestoapoptosisacellsHepG2.2.15andJurkatcells.Thehepatocarcinomacellsediatedby

4、lipofectin.ThereverseactionacellsRNA,therateofFasLexpressionandtheapoptoticrateofJurkatcellsincocultureassaysalldecreased.Conclusion:FasLexpressedbythehepatocarcinomacellscouldinhibittheimmunefunctionofTlymphocytes.Itportantmechanismsofimmuneescapeinhepatocarcinomacells.FasLantisenseoligon

5、ucleotidecouldreversetheactionofimmuneinhibition.【KEYReagent,为美国Invitrogen公司产品。TRIzolReagent、ReverseTranscriptase、TaqDNApolymerase等RTPCR用试剂，均购自上海生工生物工程技术公司，引物及FasL反义、正义寡核苷酸（SODN），由上海生工生物工程技术公司合成。1.2细胞培养人肝癌细胞株HepG2.2.15及Jurkat细胞由中国医学科学院提供。HepG2.2.15细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中；Jurkat细胞培养于含10%小牛血清

6、的RPMI1640培养液中。37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。1.3流式细胞术（FCM）检测肝癌细胞表面Fas、FasL表达及Jurkat细胞表面Fas表达收集正常生长的HepG2.2.15细胞及Jurkat细胞，PBS洗两次，分别加入1∶30稀释的兔抗人Fas、FasL抗体，用PBS代替一抗作阴性对照，4℃反应30min；PBS洗一次，加入1∶90稀释的FITC标记的羊抗兔IgG抗体，4℃避光反应30min，PBS洗一次，加入PBS500μl，上机检测。1.4肝癌细胞FasL功能检测HepG2.2.15细胞2×106/孔接种至6孔培养板，培养至细胞密度达80%以上时，去

7、除培养液并冲洗板孔。实验组（A组）：HepG2.2.15细胞加入Jurkat细胞4×105/孔；NOK2处理组（B组）：HepG2.2.15细胞加入10μg/ml的FasL中和抗体NOK2400μl，孵育1h后加入与A组等量Jurkat细胞；对照1组（C组）：Jurkat细胞单独培养；对照2组（D组）：Jurkat细胞加入与B组等量NOK2。继续培养24h，收集悬液的Jurkat细胞，加PI及AnnexinVFITC染色，FCM检测细胞凋亡。可出现四个细胞群；死亡细胞（Annexin-/PI+）、正常活细胞（Ann