fasl反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸 的实验研究

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1、FasL反义寡核苷酸逆转肝癌细胞免疫逃逸的实验研究作者：张娇刘倩王杰毛海婷【摘要】目的：研究FasL反义寡核苷酸对肝癌细胞Fas/FasL途径免疫逃逸的逆转作用。方法：用流式细胞术检测肝癌细胞系HepG2.2.15细胞表面Fas、FasL的表达及Jurkat细胞表面Fas的表达；用HepG2.2.15细胞与Jurkat细胞共培养方法，研究FasL诱导T细胞凋亡的功能；用脂质体介导法转导FasL反义寡核苷酸入肝癌细胞，并通过检测细胞表面FasL表达、RTPCR及细胞共培养方法研究FasL反义寡核苷酸转导对肝癌细胞免疫抑制的逆转作用。结果：①HepG2

2、.2.15细胞低表达Fas，却表达有功能的FasL，与高表达Fas的Jurkat细胞共培养可诱导后者凋亡；②肝癌细胞转入FasL反义寡核苷酸后，FasLmRNA降低；细胞表面FasL表达下降；与Jurkat细胞共培养，Jurkat细胞的凋亡率下降。结论：肝癌细胞表达的FasL可抑制T细胞的免疫功能，是肝癌细胞免疫逃逸的重要机制之一；FasL反义寡核苷酸转导可以逆转肝癌细胞的免疫抑制作用。【关键词】肝肿瘤・Fas/FasL・免疫逃逸・寡核苷酸类，反义TheFasLantisenseoligonucleotid

3、ecouldreversetheimmuneescapeinhepatocarcinomacellline【ABSTRACT】Objective:ToinvestigatethereverseactionofFasLantisenseoligonucleotideontheimmuneescapethroughFas/FasLpathacells.Methods:Fas、FasLexpressionofhepatocarcinomacelllineHepG2.2.15andFasexpressionofJurkatcellinedbyfloetry

4、.FasLfunctionofinducingTlymphocytestoapoptosisacellsHepG2.2.15andJurkatcells.Thehepatocarcinomacellsediatedbylipofectin.ThereverseactionacellsRNA,therateofFasLexpressionandtheapoptoticrateofJurkatcellsincocultureassaysalldecreased.Conclusion:FasLexpressedbythehepatocarcinomace

5、llscouldinhibittheimmunefunctionofTlymphocytes.Itportantmechanismsofimmuneescapeinhepatocarcinomacells.FasLantisenseoligonucleotidecouldreversetheactionofimmuneinhibition.【KEYReagent,为美国Invitrogen公司产品。TRIzolReagent、ReverseTranscriptase、TaqDNApolymerase等RTPCR用试剂，均购自上海生工生物工程技术公司

6、，引物及FasL反义、正义寡核苷酸（SODN），由上海生工生物工程技术公司合成。1.2细胞培养人肝癌细胞株HepG2.2.15及Jurkat细胞由中国医学科学院提供。HepG2.2.15细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中；Jurkat细胞培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中。37℃、5%CO2、饱和湿度下培养。1.3流式细胞术（FCM）检测肝癌细胞表面Fas、FasL表达及Jurkat细胞表面Fas表达收集正常生长的HepG2.2.15细胞及Jurkat细胞，PBS洗两次，分别加入1∶30稀释的兔抗人Fas、FasL抗体，用P

7、BS代替一抗作阴性对照，4℃反应30min；PBS洗一次，加入1∶90稀释的FITC标记的羊抗兔IgG抗体，4℃避光反应30min，PBS洗一次，加入PBS500μl，上机检测。1.4肝癌细胞FasL功能检测HepG2.2.15细胞2×106/孔接种至6孔培养板，培养至细胞密度达80%以上时，去除培养液并冲洗板孔。实验组（A组）：HepG2.2.15细胞加入Jurkat细胞4×105/孔；NOK2处理组（B组）：HepG2.2.15细胞加入10μg/ml的FasL中和抗体NOK2400μl，孵育1h后加入与A组等量Jurkat细胞；对照1组（C组）

8、：Jurkat细胞单独培养；对照2组（D组）：Jurkat细胞加入与B组等量NOK2。继续培养24h，收集悬液的Jurka