大肠埃希菌耐药性质粒的提取及鉴定

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1、大肠埃希菌耐药性质粒的提取及鉴定张帆，李菁华，史红艳，孙延波【摘要】目的检测大肠埃希菌对9种抗生素的耐药性，探讨大肠埃希菌耐药的分子机制。方法采用平皿二倍稀释法测定40株临床分离的大肠埃希菌对抗生素的敏感性，同时用碱裂解法对耐药菌株进行质粒的抽提，将得到的质粒转化至受体菌JM109进行质粒耐药性的鉴定。结果40株大肠埃希菌对头孢菌素等9种抗生素呈现出不同程度的耐药现象。对氨苄西林和青霉素的耐药性分别达到了87.5%和97.5%。从两株耐药大肠埃希菌中提取出质粒，对其中一株进行转化鉴定，确定为耐药质粒，大小约为3.0kb。结论临床分离大肠埃希菌对多种抗

2、生素表现出较高的耐药性，而耐药性质粒的存在是细菌产生耐药性的机制之一。【关键词】大肠埃希菌；耐药性；质粒ExtractionandidentificationofresistanceplasmidsinEscherichiacoli【Abstract】ObjectiveTodetecttheantibioticsusceptibilityofE.colistrainsto9antibacterialagentsandtoexplorethemolecularmechanismofresistanceinE.coli.MethodsAntibiotic

3、susceptibilityof40strainsofE.coliisolatesethod.PlasmidDNAidation.Results40strainsofE.coliisolatesexhibitresistanceto9differentantibioticsinsomeextent.Theresistantratestoampicillinandpenicillinidsof3.0kbtolecularmechanismsofresistanceinsomestrainsofE.coliediatedbyRplasmidinpart.

4、【Keyid大肠埃希菌是引起呼吸道和泌尿生殖道感染的常见条件致病菌［1］。随着第三代头孢菌素的广泛应用，此类细菌表现出较严重的多重耐药性，并常导致严重的院内感染，使得抗菌感染治疗变得棘手。近年来大量文献证实了产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是造成大肠埃希菌对第三代头孢菌素的耐药性重要原因［2］。质粒介导的耐药性是细菌产生耐药性的原因之一，携带多种耐药表型的R质粒常在某一地区流行并在一定条件下可在细菌中传播。因此，对耐药机制的研究是预防和控制细菌耐药的战略措施［3］。本研究对40株临床分离的大肠埃希菌进行了耐药性的测定，并对耐药菌株进行了质粒的提取及

5、鉴定。　　1材料与方法1.1材料1.1.1菌株来源40株大肠埃希菌由临床分离并进行鉴定。大肠杆菌JM109由本实验室保存。1.1.2药品和试剂氨苄西林，青霉素（购自华北制药股份有限公司）；头孢拉定，头孢噻肟钠，头孢哌酮钠，头孢曲松钠（购自上海先锋药业有限公司）；红霉素（购自大连美罗大药厂）；阿奇霉素（购自杭州澳亚生物技术有限公司）；盐酸环丙沙星（购自贵州科伦药业有限公司）；酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）（购自BioFlux公司）；普通营养琼脂培养基（购自杭州天和微生物试剂有限公司）。质粒提取液：溶液Ⅰ：含50mmol/L的葡萄糖，25mmol/L

6、Tris·C1（pH8.0），10mmol/LEDTA；溶液Ⅱ：含0.2mol/LNaOH和1%SDS（现用现配）；溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，HAc11.5ml，水28.5ml配置成100ml的溶液。1.2方法1.2.1药敏试验采用常规琼脂二倍稀释法检测40株大肠埃希菌对9种抗生素的最低抑菌浓度（MIC）以及MIC50和MIC90。1.2.2质粒DNA的提取采用碱裂解法［4］。挑取单个菌落，接种于7mlLB液体培养基（含抗生素）中，37℃、震荡培养过夜（约12～14h）。取1.5ml培养物加入Eppendorf管中，4℃、12000×g离心

7、1min，弃上清，使细菌尽可能干燥。将细菌重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡，使菌体分散。加200μl新配制的溶液Ⅱ，上下颠倒5次混匀，置冰上2min。加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和的混匀10s，置冰上5min。4℃、12000×g离心7min，小心移出上清于另一Eppendorf管中。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，震荡混匀1min，4℃、12000×g离心5min，小心移出上清于另一Eppendorf管中。重复上一步骤再抽提1次。加入1/10体积的3mol/LNaAc混匀，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃、12000×

8、g离心15min，去上清，室温干燥。70%乙醇洗涤1次，室温干燥5min。沉淀溶于20μlTE（含RNAse