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《水蛭提取物对人肝癌hepg2细胞体外抑制作用研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞体外抑制作用研究论文.freelg/mL时,对人肝癌HepG2细胞的增殖有明显抑制作用,细胞数目明显下降,并呈剂量依赖性,与水提醇沉法提取物比较,差异有统计学意义(P＜0.01)。吖啶橙染色可见典型的凋亡细胞形态学特征。结论水蛭液氮快速冻融法提取物可体外抑制HepG2细胞的增殖并诱导凋亡,其作用明显优于水蛭水提醇沉法提取物。【关键词】肝癌HepG2细胞；水蛭提取物；增殖；凋亡；液氮快速冻融法Abstract：ObjectiveTostudytheinhibitioneff
2、ectofleechextractonHepG2cells.MethodsHumanhepatocellularcancercelllineHepG2ethodoffreeze-thaethodoforphousinedbyMTTassayandAcridineorange(AO)fluorescentstainingmethodrespectively.ResultThe6～15mg/mLdrugconcentrationsofleechextractbymethodoffreeze-thaanner
3、,andtheeffectethodoforphologicalfeaturesofapoptoticcellsethodoffreeze-thaethodofaHepG2cells；leechextract；proliferation；apoptosis；freeze-thaa公司产品。1.3药物水蛭原药材购于湖南中医药大学第一附属医院,并由湖南省中医研究院超微工程中心制备成水蛭超微粉。提取物以液氮快速冻融法和常规水提醇沉法制备2-3。液氮快速冻融法：取水蛭超微粉1.5g置15mL离心管内,加10mL
4、灭菌双蒸水制成混悬液,再将离心管置液氮内5min,取出,立即放入37℃水浴中迅速融解,重复3次,3000r/min离心10min,取上清液过滤,滤液冷冻干燥18h即得水蛭冻干粉,-20℃保存备用。水提醇沉法：取水蛭超微粉25g,加10倍水煎煮1h,过滤,重复3次,合并滤液并浓缩成2g/mL,加95%乙醇,使含醇量至75%,静置过夜,回收乙醇,粉碎成细粉,-20℃保存备用。临用前以培养基配成实验所需浓度工作液,0.22μm滤器正压过滤除菌。1.4四甲基偶氮唑盐试验人肝癌HepG2细胞以1×l04个/孔接种
5、于96孔培养板中,然后加入不同浓度的水蛭提取物工作液,使其终浓度分别为3、6、9、12、15mg/mL,同时设置对照孔,加等体积的DMEM培养基。37℃、5%CO2培养48h后,每孔加入5mg/mLMTT工作液20μL,再孵育4h,去上清,加入二甲基亚砜150μL/孔,旋涡振荡器振荡充分溶解结晶,酶标仪492nm波长处测定每孔的吸光度值(OD),每组重复5孔,计算细胞生长抑制率(对照组OD值－药物组OD值)/对照组OD值×100%。1.5绘制细胞生长曲线人肝癌HepG2细胞以1×l05个/孔接种于6孔培
6、养板中,然后加入不同浓度的水蛭提取物工作液,设置对照孔,加等体积的DMEM培养基。倒置显微镜下观察各药物浓度水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞形态的影响及生长情况,干预24、48、72h时,2.5g/L胰蛋白酶消化收集细胞,血球计数板计数,每孔重复3次,取平均值绘制细胞生长曲线。1.6吖啶橙荧光染色各浓度药物干预培养于盖玻片上的人肝癌HepG2细胞48h后,95%乙醇固定,0.01%AO染液中染色,封片后置荧光显微镜(激发波长405nm)下观察。1.7统计学方法实验数据用x±s表示,应用SPSS11.5统
7、计学软件包分析处理。组内比较采用单因素方差分析,组间比较采用成组t检验。2结果2.1水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用(见表1)表1水蛭提取物对人肝癌HepG2细胞增殖的影响(略)注：与对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01；与3mg/mL水蛭组比较,##P＜0.012.2细胞形态学观察及细胞计数6～15mg/mL浓度水蛭液氮快速冻融法提取物作用于人肝癌HepG2细胞48h后,可观察到细胞萎缩变圆,出现漂浮细胞碎片与凋亡小体,生长缓慢,细胞数量明显减少,其中9～15mg/mL药物浓度细
8、胞数目明显下降,至72h时,12～15mg/mL药物浓度细胞基本死亡。水蛭水提醇沉法提取物15mg/mL时才出现细胞数目缓慢下降。2.3荧光显微镜观测细胞凋亡形态经AO染色后,对照组细胞结构清晰,胞膜完整,核仁清晰,胞质清晰,呈黄绿色荧光。水蛭液氮快速冻融法提取物处理后,细胞体积明显变小,细胞外形皱折,胞膜不完整,结构模糊,凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。水蛭水提醇沉法提取物作用后15mg/mL高浓度
