苯丁酸钠体外对人肝癌细胞hepg2增殖和凋亡的影响论文

《苯丁酸钠体外对人肝癌细胞hepg2增殖和凋亡的影响论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、苯丁酸钠体外对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响论文孟玫，王春亭，蒋进皎，张继承，姜军梅【摘要】［目的］探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂苯丁酸钠（PB）体外对人肝癌细胞HepG2增殖和凋亡的影响。［方法］不同浓度苯丁酸钠处理HepG2，应用MTT比色法观察苯丁酸钠对HepG2的生长抑制作用，落射荧光显微镜、DNA电泳和流式细胞仪观察HepG2的凋亡，I1640（Gibco公司产品），置于37°C5%CO2的孵箱内培养。48h传代，0.25%的胰酶、0.02%EDTA（乙二胺四乙酸二钠）消化。取对数生

2、长期的细胞进行实验。1．2药物苯丁酸钠购自ALEXIS，用RPMI1640培养基溶解为20mmol/L浓度备用。1．3四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色实验将HepG2细胞悬液浓度调整为5×104/ml，每孔200μl接种于96孔板，实验组分别加入不同浓度的苯丁酸钠，对照组不加药，另设空白对照孔（只加培养基，无细胞），每组设三个平行重复孔。继续培养，分别在48h、72h各取三孔加入MTT（5mg/ml）20μl，放置孵箱内4h后弃上清加入10%的SDS（十二烷基磺酸钠）200μl，过夜。震荡15min

3、，用全自动酶标仪（DenleyDrangonK2）检测570nm处的吸光度值（A值）。抑制率（%）=（A对照-A实验）/（A对照-A空白）×100%。1．4荧光染色观察细胞凋亡常规收集对照组、苯丁酸钠处理组细胞，4℃PBS洗涤2次。加入荧光染料Hoechst33342（Anaspec产品）至终浓度为2.5μg/ml，37℃避光孵育染色30min，取细胞悬液滴于清洁的载玻片，盖上盖玻片，落射荧光显微镜（JEOL-1200EX型）下观察细胞。1．5流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡对数生长期的细胞用无

4、血清的RPMI1640培养24h同步化后，分组干预48h。收集不同处理组细胞，4℃PBS洗涤2次，计数，调整细胞浓度为1×106个/ml，取100μl细胞悬液与含1%RNA酶的Tis-HCl缓冲液混匀共同孵育10min，加入碘化丙啶（PI）和异硫氰酸荧光素（flucresceinisothiocyanate，FITC）标记的磷脂酰结合蛋白（AnnexinV）各5μl混匀，避光37℃孵育30min，FCM（FACScan美国BD公司产品）检测，凋亡细胞AnnexinV-FITC（+）PI（-），正

5、常活细胞AnnexinV-FITC（-）PI（-），坏死细胞AnnexinV-FITC（+）PI（+），利用CellQuest功能软件进行参数获取和数据分析。1．6DNA电泳收集对照组，苯丁酸钠处理组细胞各5×107，4℃PBS洗涤2次，采用常规的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法。提取出的DNA用2%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色AlphalmagerTM2200数字电泳凝胶成像系统成像分析。1．7Tris-HClpH7.5，150mMNaCl，1g/LSDS，1mMDTT，10ml/LN

6、p-40，10g/L脱氧胆酸钠，25mg/L亮抑素，25mg/L胰蛋白酶抑制剂，1mMPMSF）提取细胞总蛋白。蛋白定量采用BCA法。调节每份样品浓度，加入等体积2×SDS加样缓冲液，煮沸5min。每孔加样20μg蛋白质，经SDS-PAGE电泳后转膜，与鼠抗人Bcl-2（C-2）、鼠抗人Bax(N-20)单克隆抗体37℃温育2h，4℃过夜。与碱性磷酸酶标记的兔抗鼠IgG37℃温育1h，加入ECL化学发光试剂，暗室显色1min，X线片曝光，利用AlphalmagerTM2200图像处理软件对结果进

7、行辉度扫描，计算电泳条带的积分吸光值。以上抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，显色剂由武汉博士德公司提供。1．8统计学处理每次实验至少重复3次，计量数据以x±s表示，统计学分析采用SPSS软件进行one-mol/L作用48h后HepG2细胞出现细胞核变小，染色质聚集呈不均匀块状并发出粉红色荧光，部分碎裂成凋亡小体。苯丁酸钠可诱导HepG2凋亡，见图1。2．3流式细胞仪检测细胞凋亡对照组和处理组相比较，对照组早期凋亡的细胞24h、48h、72h分别为9.6%±1.5%、18.4%±2.3%、2

8、1.2%±2.6%，苯丁酸钠4mmol/L处理24h、48h、72h早期凋亡细胞分为37.2%±1.6%、48.3%±3.7%、56.8%±3.5%，各时间凋亡细胞比较差异均有显著性（P0.05），提示苯丁酸钠可诱导HepG2凋亡（见图2）。分别提取苯丁酸钠4mmol/L处理48h、72h和对照组的细胞DNA经琼脂糖凝胶电泳，苯丁酸钠处理组的细胞可见典型的DNA梯型条带，提示有细胞凋亡发生（见图3）。2.4TT结果显示苯丁酸钠的作用有时间和剂量效应关系（P0.05）。经苯丁酸钠处理的细胞DNA凝