cpg odn增强乙肝疫苗免疫反应的研究论文

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1、CpGODN增强乙肝疫苗免疫反应的研究论文戴帆，董斌，郭晓磊，石碧珠，方丽娟，莫家琳，田素娟，孟民杰【摘要】目的研究人工合成的CpGODN对乙肝表面抗原的免疫增强效应.freelmunologicalenhancementofHBsAgsofmicemunizetheBALb/cmice,thehighdosegroupcouldbedetectedquicklyinshotterm,thelevelsofantibodiesingroupsthelevelsofantibodiesingroupsmu

2、nologicaleffectofHBsAgs.Keymunoadjuvant;humoralimmunityCpG基序是一种具有非特异性免疫刺激能力的DNA序列，为非甲基化的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸重复序列。CpGODN(unmethylatedCpGmotifbasedoligodeoxynucleotide)是人工合成的含未甲基化CpG基序的寡核苷酸序列。CpGODN可刺激人类和多种动物产生自然免疫和获得性免疫，主要通过TLR9信号系统活化免疫系统，最终促使多种免疫细胞的成熟分化和增殖，包括B淋巴细胞

3、、T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞和DC细胞。CpGODN能快速活化T、B细胞，诱导Th1型免疫反应并能促进抗原递呈细胞的增生和成熟1。现阶段我国对乙型肝炎的预防主要是通过注射乙型肝炎疫苗，但接种免疫过程中和接种免疫后会出现免疫较弱和不免疫现象2,3。所以，选择一种安全有效的免疫佐剂是增强免疫效果的有效途径。本文通过测定不同时间段的小鼠注射CpGODN和乙肝表面抗原后的抗体滴度，评价CpGODN作为免疫佐剂增强乙肝疫苗的免疫效果。1材料与方法1.1材料1.1.1动物BALb/c小鼠，雄性，6周龄，

4、体质量18～22g，SPF级，购自中山大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)20040011。1.1.2试剂血源性乙肝表面抗原购自上海前尘生物，CpGODN由本实验室保存。1.2动物分组及免疫方案1.2.1动物分组50只BALb/c小鼠根据随机分配表，随机平均分成5组：第1组为HBsAg和高剂量CpGODN联合免疫组，第2组为HBsAg和中剂量CpGODN联合免疫组，第3组HBsAg和低剂量CpGODN联合免疫组，第4组为HBsAg单用组，第5组为生理盐水对照组。各组饲养条件相同。1.2.2动

5、物免疫分别于第0、2、4周免疫BALb/c小鼠，每次免疫剂量相同。第1组：尾静脉注射含2μgHBsAg和100μgCpGODN生理盐水溶液，100μL/只;第2组：尾静脉注射含2μgHBsAg和1μgCpGODN生理盐水溶液，100μL/只;第3组：尾静脉注射含2μgHBsAg和10ngCpGODN生理盐水溶液，100μL/只;第4组：尾静脉注射含2μgHBsAg生理盐水溶液，100μL/只;第5组：100μL生理盐水/只。1.3乙肝表面抗原检测1.3.1血清采集断尾后玻璃毛细管采血，室温自然凝固，

6、常温离心后取上清，-20℃保存。1.3.2抗原检测96孔板用碳酸氢钠缓冲液(15mmol/LNa2CO3，355mmol/LNaHCO3，pH9.6)适当稀释的乙肝表面抗原包被，4℃过夜孵育。用含Tol/LPBS,0.1%Tin，每孔加入100μL经PBS(0.1mol/LPBS,1%BSA)适当稀释的待测血清，37℃孵育90min。PBS洗涤5次，每孔加入100μL1000倍稀释的HRP标记的乙肝表面抗原，37℃孵育40min。PBS洗涤5次，每孔加入100μLTMB底物(含0.1mg/mL3’3’5’

7、5’四甲基联苯胺的磷酸盐柠檬酸缓冲液，pH5.4，用前加5mL30%H2O210mL)，37℃孵育1h。每孔加入100μLH2SO2(0.2mol/L)终止显色反应。BioRad680测定A450/630读数。1.4统计学分析应用SPSS统计软件，采用重复测量方差分析对数据进行分析，P0.05为差异有显著性。2结果2.1小鼠免疫后7～28d外周血中乙肝表面抗体的平均滴度变化乙肝表面抗原单用组的抗体在7～17d时间段内检测不到，乙肝表面抗原和低剂量CpGODN联合免疫的抗体在第14天检测到，乙肝表面抗

8、原和中剂量CpGODN联合免疫组的抗体在第10天检测到，乙肝表面抗原和高剂量CpGODN联合免疫的抗体出现时间较早，在第7天即可检测到。在第14～28天的各个时间点上，乙肝表面抗原和高剂量CpGODN联合免疫组的抗体滴度均显著高于乙肝表面抗原和中剂量CpGODN联合免疫组、乙肝表面抗原和低剂量CpGODN联合免疫组(P0.05);在第14、17、21天时间点上，乙肝表面抗原和中剂量CpGODN联合免疫组、乙肝表面抗原和低剂量C