survivin在槲皮素诱导肝癌细胞smmc7721凋亡中的调节作用研究论文

《survivin在槲皮素诱导肝癌细胞smmc7721凋亡中的调节作用研究论文》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、Survivin在槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡中的调节作用研究论文【摘要】目的研究槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721凋亡，探讨其诱导SMMC7721细胞凋亡与survivin蛋白表达和caspase-3活性的关系。方法采用MTT法检测槲皮素对肝癌SMMC7721细胞生长的抑制作用，Hoechst33258荧光染色对细胞凋亡进行形态学检测，流式细胞术检测细胞周期变化，免疫细胞化学检测survivin蛋白表达，分光光度法检测caspase-3的活性变化。结果槲皮素抑制肝癌SMMC7721细胞

2、增殖的作用明显，且呈浓度和时间依赖性，槲皮素处理48h的IC50为84.24μmol·L-1。形态学检测显示出细胞凋亡的特征变化.freelicroscope.Cellcycleetry(FCM).Expressionofsurvivinproteinmunocytochemistrystaining.Activityofcaspase-3etry.ResultsQuercetinhadasignificantinhibitionongroe-dependentmanner.TheIC50ol·L

3、-1aftercellsicroscope.ItacelllinesSMMC7721；Apoptosis;Survivin；Caspase-3槲皮素（Quercetin,Que,3,5,7,3',4'-五羟基黄酮）广泛存在于植物界，大约68%的植物中都含有。槲皮素药理作用广泛，具有降血压、降血脂、扩张冠状动脉、抗血小板聚集、抗炎、抗过敏、抗心律失常和清除自由基等多种生物活性及药理作用［1～5］。近年发现槲皮素不仅对多种致癌剂、促癌剂有拮抗作用，而且可以抑制多种恶性肿瘤细胞的生长［6～10］。Sur

4、vivin蛋白是新近发现的凋亡抑制因子，在肿瘤的发生发展中具有重要地位。槲皮素对肿瘤细胞中survivin蛋白表达的影响，至今还不十分清楚。因此本课题试图研究survivin表达在槲皮素诱导SMMC7721细胞凋亡中的调节作用，为探讨槲皮素诱导肝癌细胞SMMC7721细胞凋亡的机制提供实验依据。1材料RPMI1640培养液，胎牛血清（Hyclone公司），槲皮素（Sigma公司），Hoechst33258（Sigma公司），免疫组化染色SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），兔抗人surviv

5、in多克隆抗体（北京中杉金桥生物技术有限公司），Caspase-3分光光度法检测试剂盒（南京凯基生物科技发展有限公司）。2方法2.1细胞培养人肝癌细胞株SMMC7721，细胞单层接种在含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中，在饱和湿度，温度为37℃，CO2浓度为5％的培养箱中培养。2.2细胞生长抑制肝癌细胞SMMC7721，5×104个/ml，接种于96孔培养板，每孔200μl。培养24h。更换10%FBS的含药培养基，使槲皮素终浓度为12.5，25，50，100，200μmol·L-1，每一

6、浓度重复5孔，分别培养24，48，72h，培养终止前4h加入MTT（5mg·L-1）每孔20μl，37℃孵育。终止时弃上清后每孔加入150μl二甲基亚砜，振荡混匀10min，使结晶物充分溶解后，在酶标仪（λ=490nm）上测各孔的吸光度（OD）值，重复3次，按下式计算细胞生长抑制率：肿瘤细胞生长抑制率（IR）=｛1-实验组平均OD值对照组平均OD值｝×100%（以空白组OD值调零）2.3细胞形态学变化观察取对数生长期SMMC7721细胞5×104个，加入放有盖玻片的六孔板内。培养24h后，更换10

7、%FBS的含药培养基，设空白对照组和加药实验组，使加药组槲皮素终浓度分别达到40，80，160μmol·L-1，继续培养48h后，用PBS洗两次，然后用固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定15min，用PBS洗两次，37℃Hoechst33258染色液（5mg·L-1）染色15～30min，用PBS洗两次，用中性树脂封片，荧光显微镜下观察细胞形态并拍照。镜下随机找到5个不重复区，计数200个细胞中凋亡细胞数，其中凋亡细胞所占百分比即为细胞凋亡率。2.4流式细胞仪(FCM)检测细胞周期以40，80，1

8、60μmol·L-1的槲皮素处理SMMC7721细胞48h后，收集细胞制成单细胞悬液，0.01mol·L-1PBS（pH7.4）洗两次，70%冰乙醇固定过夜，碘化丙啶(PI)染色，流式细胞仪检测，分析细胞周期，以未处理的细胞为对照组。2.5免疫细胞化学法检测survivin蛋白表达取对数生长期肿瘤细胞SMMC7721，2×105个/孔细胞接种于放置有盖玻片的6孔板，待自然贴壁后，设加药实验组和空白对照组，实验组加入槲皮素，使槲皮素终浓度分别达到40，120μmol·L-1。24h后