抑癌基因p16在燃煤型砷中毒患者中突变及甲基化的情况与意义

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1、抑癌基因p16在燃煤型砷中毒患者中突变及甲基化的情况与意义陈志磊1　安凤杨1　刘笑宇2　刘　欢2　郭云然2　于海琦21河北大学临床医学院河北省保定市0710002河北大学基础医学院河北省保定市071000【摘　要】目的：分析与探讨燃煤型砷中毒患者中抑癌基因p16突变与甲基化的情况及意义。方法：选取120例2013年4月-2015年5月在我院收治的燃煤型砷中毒患者，依照皮肤病变病理学诊断结果，将所有患者分为癌前组（24例）、癌病组（20例）及普通病变组（76例），通过PCR与PCR-SSCP产物克隆测序检测突变热点显子，并通过甲基化内切酶分析第1外显子。结果：通过PCR与PCR-SS

2、CR产物克隆测序对燃煤型砷中毒病人外周血DNA进行分析，没有检测出抗癌基因p16第2外显子发生突变。通过SmaI酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA后，癌变组患者中，扩增出抗癌基因p16第1外显子片段4例，普通病变组与癌前组患者没有检测出SmaI位点甲基化情况。结论：研究表明，p16基因由于高度甲基化是造成p16基因在砷性肿瘤中失活的关键方式，而且在砷致癌中发挥着重要作用。.jyqkaI以及电泳用琼脂糖，以上试剂均为上海TaKaRa公司提供。所选仪器为全自动紫外分光光度计、电泳仪等。1.3提取DNA空腹采取患者2ml静脉血，并行EDTAK2抗凝，采用酚氯仿法对基因组患者DNA进行抽提，

3、紫外分光光度计实施定量，将其稀释到大约100ng/ul，在-20℃环境下保存。1.4PCR-SSCP通常p16基因点在第2外显子发生，而且由于第2外显子相对比较大，通过两对引物实施扩增，通过琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定后，去PCR产物5ul，再加入SSCP缓冲液（5ul）混匀。1.5甲基化分析通过内切酶SmaI实施DNA酶切，并在30℃环境下进行16h的消化，65℃环境下灭活大约20min,将消化完成的DNA当作模板，并对p16基因第一外显子进行扩增，CG甲基化将这种酶切作用阻断，若DNA通过SmaI消化后依旧可以向第一外显子扩增，表示这种基因SmaI位点甲基化。1.6统计学处理采

4、用SPSS16.0软件进行统计学处理，X2检验数据分析，P<0.05表示差异性比较明显，具有统计学意义。2结果2.1抗癌基因p16第2外显子突变检测结果通过PCR与PCR-SSCR产物克隆测序对燃煤型砷中毒病人外周血DNA进行分析，没有检测出抗癌基因p16第2外显子发生突变。2.2分析抗癌基因p16第1外显子甲基化结果通过SmaI酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA后，癌变组患者中，扩增出抗癌基因p16第1外显子片段4例，普通病变组与癌前组患者没有检测出SmaI位点甲基化情况，见表1。3讨论抑癌基因p16是近年来所研制的一种在细胞分裂中直接作用的一种基因，抑癌基因p16主要参与肿

5、瘤病变发生及发展，其中的抑制细胞p16和视网膜细胞瘤基因、p53基因、细胞周期素依赖性集美以及细胞周期素等组成周期细胞反馈调节环，对人体细胞周期具有调控作用。本研究通过PCR、PCR-SSCP产物克隆测序检测突变热点显子，没有检测出突变现象。并通过甲基化内切酶分析第1外显子，研究结果发现，通过SmaI酶切燃煤型砷中毒病人外周血DNA后，癌变组患者中，扩增出抗癌基因p16第1外显子片段4例，普通病变组与癌前组患者没有检测出SmaI位点甲基化情况。砷是一种致癌物质，在生物机体与外在环境中均存在甲基化代谢转换过程，采用甲基化的方式降低砷的毒性，然而，因为砷转化途径类似于DNA甲基化，很可

6、能会导致抑癌基因或者原癌基因甲基化模式发生变化，具有致癌作用，而p16基因由于高度甲基化是造成p16基因在砷性肿瘤中失活的关键方式，而且在砷致癌中发挥着重要作用。..