补阳还五汤对脊髓损伤大鼠脊髓组织血小板活化因子受体mrna表达的影响

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1、补阳还五汤对脊髓损伤大鼠脊髓组织血小板活化因子受体mRNA表达的影响作者：张继平,林爱华李蜀光,文凤妮,姚晖,谢伟贤,王志彬,李齐欢【摘要】　　[目的]观察补阳还五汤对脊髓损伤(SCI)模型大鼠脊髓组织血小板活化因子受体(PAFR)mRNA表达的影响。[方法]选用SPF级TCCTTGTCGTCCACATCTTCATCACCTCCTGTAMRA，探针长度31bp，Tm69℃;RNA的提取及逆转录试剂由上海生工提供;DNA扩增试剂及标准品由广州市达晖生物科技有限公司提供;其他试剂均为国产分析纯。　　1.3实验动物及造模SPF级g/L水合氯醛3

2、.5g/kg腹腔注射麻醉大鼠，背部剪毛，将动物俯卧固定于手术台上，100mg/L的活力碘消毒，以T12棘突为中心取背部正中切口，长约3cm，显露T11L1棘突及椎板。用特制的手术钳咬除T11下半、T12全椎板及L1上半椎板，以脊髓为中心显露直径约2.8mm圆形区，在硬膜表面垫一弯曲度与脊髓表面一致的塑料垫片。采用Allens打击法[4]，用直径约2.4mm重5g的圆柱状重锤从10cm高处，沿细玻璃导管垂直下落，打击垫片致T12脊髓急性挫伤，致伤力为5×10gcf(gram·cm·force)，逐层缝合伤口。造模完成后，每天肌注青霉素钠2万U

3、，1次/d，单笼管理饮食，每8h按摩膀胱排尿，并用碘伏消毒伤口，直至膀胱功能恢复。模型大鼠观察1周，伤情稳定后，模型组进行随机化分组。　　1.4动物分组及给药76只g·kg-1·d-1)，正常组给予蒸馏水;给药体积均为20mL/kg，用药2周结束实验。　　1.5脊髓组织PAFRmRNA表达测定给药结束后，迅速切取脊髓损伤段上下约1cm大小的脊髓组织，置于Eppendorf管中，-70℃冰箱保存。采用RTPCR法检测脊髓组织PAFRmRNA表达水平。　　1.5.1总RNA的提取电子天平称取脊髓组织50mg，严格按照RNA提取说明书提取总RN

4、A，-20℃冰箱保存。紫外可见分光光度计观察D260/D280的比值，检测样品中RNA纯度;普通琼脂糖凝胶电泳后紫外灯观察28s条带与18s条带亮度比，检测RNA的完整性。　　1.5.2mRNA的逆转录及cDNA的荧光定量扩增严格按照说明书进行操作。PCR反应总体积为50μL，反应条件：93℃预变性2min，循环参数：93℃变性45s，55℃退火延伸1min，10个循环(未采集荧光);93℃变性45s，55℃退火延伸1min，30个循环(采集荧光)。　　1.6统计学方法应用SPSS10.0软件进行分析，采用单因素方差分析，多重比较用SNKq检

5、验。　　2结果　　2.1总RNA纯度及mRNA的完整性鉴定根据测定要求，在mRNA分析前，需对所有样品进行总RNA纯度及mRNA的完整性鉴定，达到规定要求后才能进行下一步测定。本研究采用紫外可见分光光度计对总RNA的纯度进行鉴定，D260/D280比值在1.8～2.0之间;经琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察可见28s条带及18s条带，两条带亮度比约为2：1，总RNA的纯度及完整性满足实验要求，电泳鉴定图如图1所示。　　2.2各组大鼠脊髓组织PAFRmRNA表达量比较表1结果显示，SCI模型大鼠PAFRmRNA表达显著降低(P<0.01)

6、,补阳还五汤组与金纳多组均可抑制脊髓组织PAFRmRNA表达，与模型组比较差异有显著性意义(P<0.01),两给药组之间比较无显著性差异(P>0.05)。.L.编辑。　　3讨论　　补阳还五汤出自晚清·王清任《医林改错》，是益气活血之名方，由生黄芪、当归尾、川芎、赤芍、地龙、桃仁、红花组成，具有益气活血通络之效。临床发现其具有中枢神经保护作用，现已广泛应用于中风后遗症、脑血管疾病等中枢神经系统损伤后的治疗[1]。PAF被认为是SCI后继发性病理损伤的重要损害因子之一，体外实验已证明[5]补阳还五汤可抑制PAFR活性。SCI后，PA

7、F释放成倍增加，可引起强烈的炎症反应，并可通过促进花生四烯酸代谢为血栓素B2、前列腺素和白三烯，三者可引发炎症的级联放大反应[6];PAF可通过收缩血管、诱导血小板聚集和形成血栓等作用，使脊髓微血管闭塞和痉挛，导致脊髓损伤部位延迟性缺血;PAF还可作为一种生物活性磷脂参与神经细胞兴奋性毒性凋亡[7]。PAF是通过与其特异性受体结合而发挥生物效应，故减少其受体数目、抑制其受体活性，是阻断PAF发挥损伤效应的关键环节之一。　　PAFR广泛存在于中枢神经系统组织细胞的表面，主要表达于小胶质细胞及神经元的表面;病理情况下，受体处于何种状态取决于配体浓

8、度和配体增加的速度;快速给予配体时，可迅速激活受体;但配体长时间作用后受体发生去敏感化，引起受体数目、亲和力下调及受体活性的改变[8]。有学者发现脊髓