deae纤维素柱层析纯化酶蛋白实验

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1、DEAE纤维素柱层析纯化酶蛋白实验（文献来自于丁香通（biomart.cn））本实验目的是以柱层析的方法进一步纯化蔗糖酶蛋0,利用DEAE纤维素树脂作为离子交换剂进行柱层析分级分离。实验方法•离子交换层析法实验方法原理实验材料试剂、试剂盒仪器、耗材利川DEAE纤维素树脂作为离子交换剂进行柱层析分级分离。酶蛋白DEAE纤维素NaOHHCLTris-HCI缓冲液NaCI足析柱收集器磁力搅拌器搅拌子烧杯玻璃砂漏斗水泵抽滤瓶pH试纸pH计三通管止水夹吸耳球紫外比色杯尿糖试纸点滴板电导率仪1.离了交换剂的处理称取1.5克DEAE纤维素（D

2、E-23）T粉，加入0.5mol/LNaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡至少0.5小时（不超过1小时），用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性，抽干后，放入小烧杯中，1m50ml0.5mol/LHCI,搅匀，浸泡0.5小时，用去离子水洗至近中性，再用0.5mol/LNaOHifi处理一次，用去离子水洗茧近中性盾，抽丁•备川（因DEAE纤维素昂贵，川后务必冋收）。实际操作吋，通常纤维素是己浸泡过并回收的，按“碱-＞酸”的顺序洗即叱因为酸洗后较容易用水洗至中性。碱洗时因过滤困难，可以先浮选除去细颗粒，抽干后用0.5mol/L

3、NaOH-O.5mol/LNaCI溶液处理，然后水洗至中性。实验步骤2.装柱与平衡先将层析柱垂直装好，在烧杯内用0.02mol/L,pH7.3Tris-HCI缓冲液洗纤维素儿次，用滴管吸取烧杯底部人颗粒的纤维素装柱，然后川此媛冲液洗柱至流出液的电导率与缓冲液相同或接近时即可上样。3.上样与洗脱上样前先准备好梯度洗脱液，本实验采川20ml,0.02mol/L，pH7.3的Tris-HCI缓冲液和20ml含0.2mol/L浓度NaCI的0.02mol/L，pH7.3的Tris-HCI缓冲液，进行线性梯度洗脱。取两个相同直径的50ml

4、小烧杯，一个装20ml含NaCI的高离子强度溶液，另一个装入20ml低离子强度溶液，放在磁力搅拌器h，迕低离了强度溶液的烧杯内放入一个小搅拌子（在细槊料管内放入-小段铁丝，两端用洒精灯加热封U），将此烧杯置于搅拌器旋转磁铁的上方。将玻璃三通插入两个烧杯中，上端接一段乳胶管，夹上止水夹，用吸坏球小心地将溶液吸入三通（轻轻松一下止水夹），立即夹紧乳胶管，使两烧杯溶液形成连通，注意两个烧杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。用5ml0.02mol/L,pH7.3的Tris-HCI缓冲液充分溶解醇级分II（注意玻璃搅棒头必须烧圆，搅拌溶解时

5、不可将离心管划伤），若溶液泥浊，则用小试管,4000r/min离心除去不溶物。取1.5ml上清液（即醇级分II样品，留待下一个实验测酶活力及蛋白含:R:），将剩余的3.5ml上清液小心地加到层析柱上，不要扰动杜床，注意要从上样丌始使用部分收集器收集，每管2.5〜3.0ml/10min。上样后用缓冲液洗两次，然后再用约20ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，至A280降到0.1以下，夹住层析柱出口，将恒流泵入U的细槊料导管放入不含NaCI的低离子强度溶液的小烧杯屮，川胶布固定塑料管，接好层析柱，打开磁力搅拌器，放开层析柱出口，开始梯

6、度洗脱，连续收集洗脱液，两个小烧杯中的洗脱液用尽活，为洗脱充分，也吋将所配制的剩余30ml商离子强度洗脱液倒入小烧杯继续洗脱，控制流速2.5〜3.0ml，10min。测定每管洗脱液的A280光吸收值。2.各管洗脱液酶活力的定性测定在点滴板上每一孔内，加一滴0.2mol/L，pH4.9的乙酸缓冲液，一滴0.5mol/L蔗糖和一滴洗脱液，反应5min，在每一孔内M时插入一小条尿糖试纸，10〜20min后观察试纸颜色的变化。用“+”兮的数門，表示颜色的深浅，即各管酶活力的人小。合丼活性最高的2〜3管，量出总体积，并将其分成10份，分别

7、倒入10个小试管，用保鲜膜封口，冰冻保存，使用时取出一管，此即“柱级分III”。注意：从上样开始收集，可能有两个活性峰，梯度洗脱开始前的第一个峰是未吸附物，本实验取用梯度洗脱开始后洗下来的活性峰。在M—张阁上lUlifli所有管的酶活力、NaCI浓度（可用屯导率代替）和光吸收值A280的曲线和洗脱梯度线。