蛋白类酶的分离纯化

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1、第四章酶的分离纯化1、酶分离纯化的原因（3条）2、酶分离纯化鉴定的依据－蛋白质的物理化学特性（9条）内容1、酶的提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶的提取4、酶的分离方法5、酶的组合分离纯化策略6、酶的浓缩、干燥与结晶细胞结构与酶分布3.1酶的提取、分离纯化技术路线细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心，过滤、沉淀、层析分离、电泳、萃取、结晶等分离方法酶的纯化过程，约可分为三个阶段：(1)粗蛋白质(crudeprotein):采样→均质打破细胞→抽出全蛋白，多使用盐析沉淀法；可以粗略去除蛋白质以外的物质。

2、(2)部分纯化(partiallypurified):初步的纯化，使用各钟柱层析法。(3)均质酶(homogeneous):目标酶的进一步精制纯化，可用制备式电泳或HPLC。酶分离纯化不同阶段3.2细胞破碎许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tw

3、een酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂

4、中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。3.3酶的提取提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。为了使蛋白质充分溶解并保持蛋白质的结构与活性，蛋白质提取缓冲液常包含的成分控制溶液pH值的缓冲对；控制溶液离子强度的无机盐；控制溶液氧化还原状态的还原剂；蛋白酶抑制剂离子螯合剂标准

5、牛血清白蛋白去污剂水和防腐剂甘油酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取PH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取PH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。3.4酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤

6、与膜分离4、层析分离5、电泳分离6、萃取分离1、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定

7、量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高而降低，这称为盐析现象。盐析的主要原理在于高浓度盐离子与蛋白质争夺水化水，破坏蛋白质分子表面的水化膜，同时由于反离子作用，也影响蛋白质分子所带电荷在一定的温度和pH值条件下（β为常数），通过改变离子强度使不同的酶或蛋白质分离的方法称为Ks分段盐析；而在一定的盐和离

8、子强度的条件下（KsI为常数），通过改变温度和pH值，使不同的酶或蛋白质分离的方法，称为β分段盐析公式logS=logS0-KsI=β-KsI在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠