DEAE纤维素梯度层析

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1、DEAE—纤维素梯度层析实验一实验原理DEAE-纤维素是以纤维素为母体接有二乙基氨基乙基（DEAE）活性基团的弱碱性阴离子交换剂,它在离子交换层析中可用于蛋白质、核酸、激素、酶等大分子的分离与纯化。对于某些组分比较复杂或性质比较相近的蛋白质样品。在采用一般的恒溶剂系统进行离子交换柱层析时，往往不容易分离，这时可采用梯度洗提（装置见图1-2）。即用一定的样品离子在不同的离子强度（或pH）溶液中对一定的离子交换剂的平衡常数不同，在洗提过程中，通过不断改变洗提的离子强度pH不变）[根据实验的具体情况，也可同时改变离子强度和pH]，以逐步改变样品中各组分与离子交

2、换剂的交换能力，最后得到分离，这种层析方式即称为梯度洗提层析。洗提剂的梯度产生如图所示，当A1=A2时，产生线形梯度；当A1>A2时，产生凹型梯度；当A1

3、1）、层析柱（2）、烧杯（3）、可调取液器（4）、量筒（5）、玻棒（6）、标签纸（7）、记号笔（8）、洗耳球3-3、实验装置图四试剂与配制4-1．实验试剂（1）、三羧甲基氨基甲烷（Tris）（2）、鸡蛋白蛋白（CEA）（3）、DEAE-52（4）、盐酸（5）、氯化钠4-2．试剂配制（1）、BufferA（20mMpH8.0Tris-HCl）的配制：称取Tris60.7mg，于一烧杯中，先加少量蒸馏水溶解，然后用稀HCl调至pH8.0，最后加蒸馏水稀释至100毫升，混匀即可。（2）、BufferB的配制：取BufferA50毫升，加氯化钠（1.0M）2.9

4、克，溶解混匀即可。（3）、CEA样液的配制：20.0mgCEA+1mlBufferA五方法与步骤1树脂的处理2装柱[柱高10.0cm]3平衡[流速0.8ml/min;30.0min]4上样[上样体积1.0ml]5洗涤[1.0ml×2次;再自动洗涤15min]6洗脱[梯度混合仪A–B杯,各倒入A-B溶液60ml最后一个峰已回到基线时，继续洗脱10分钟]7收集8测定思考题1、DEAE-纤维素最佳吸附PH范围是多少？2、DEAE-纤维素再生最适酸、碱浓度是多少？