塞来昔布联合5fu对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生

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1、塞来昔布联合5Fu对人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生【】目的探讨选择性环氧化酶2（cyclooxygenase2，cox2）抑制剂塞来昔布（celecoxib）联合5氟尿嘧啶（5fluorouracil，5fu）对实验性人结肠癌裸鼠皮下移植瘤生长的影响及作用机制。方法建立人结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型，模型建立后32只实验裸鼠随机分为四组，分别给予塞来昔布及5fu药物干预后观察各组皮下移植瘤体积、瘤重和裸鼠实验前后的体重变化，计算抑瘤率。电镜观察细胞凋亡形态,原位凋亡染色检测凋亡指数（ai），免疫组

2、化及ccoy′s5a培养液（含谷氨酰胺和10％胎牛血清）购自gibco公司。辣根过氧化酶(hrp)标记羊抗鼠、兔抗羊二抗及nc膜购自华美生物工程公司，tunel试剂盒购自roche公司，ecla公司。1.3细胞培养及结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型人大肠癌细胞株ht29采用mccoy′s5a细胞培养基（含谷氨酰胺和10％胎牛血清），常规培养于含5％co2的37℃培养箱中，当细胞达70％～80％融合时，用0．25％胰酶消化传代继续培养。收集对数生长期ht29细胞，接种于裸小鼠背部靠近后肢部位皮下，每只裸鼠接种约

3、8×106个细胞，接种完毕后采用区组随机化法随机分为四组，spf级环境下饲养1周，皮下成瘤直径均可达0.5cm左右，成瘤率为100％。对照组（a组）为纯水自由摄入，b组为塞来昔布干预组（1500ppm,1.5mg/ml）,c组为5fu干预组（20mg/kg）,d组为塞来昔布与5fu联合干预组（塞来昔布1500ppm+5fu20mg/kg）。塞来昔布给药方式为消毒蒸馏水溶解塞来昔布配制成新鲜溶液，裸鼠每日饮水自由摄入至实验结束。5fu给药方式为裸鼠腹腔注射，分组后当天给药，每日给药1次，连续给药5天

4、，每只裸鼠根据体重计算所需用药剂量，并调整注射液体量为每只裸鼠注射1ml,a组与b组裸鼠予生理盐水1ml作为溶媒，分组后当天即给予腹腔注射，连续5天，每天注射1次。观察28天后处死裸鼠，解剖剥取肿瘤标本，用游标卡尺测量瘤块的长度（a）和宽度（b），按照公式计算肿瘤的近似体积（v）：v＝a×b2/2。瘤块称重并计算抑瘤率(%)=[(对照组平均瘤重－治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重]×100％。1.4tunel法检测凋亡细胞按试剂盒所提供说明书操作。凋亡细胞胞核染色成黑褐色，而未凋亡细胞的细胞核呈淡蓝色。每张

5、切片选取10个高倍视野(×400),计数1000个细胞中的阳性细胞数,凋亡率(％)=(凋亡阳性细胞数/1000)×100％。1.5透射电镜检测细胞凋亡取移植瘤组织块60mg固定于2.5%戊二醛2小时以上后用70%乙醇配制饱和醋酸铀，搅拌30min后静置，以磷酸缓冲液漂洗3次后用4%锇酸固定，50%乙醇漂洗后包埋剂复温，将样品放入胶囊，烤箱63℃聚合72h，48h后溶胶囊，电镜下观察凋亡情况，拍照，洗片。1.6免疫组化法检测细胞色素c、caspase3与caspase9的表达移植瘤组织石蜡切片常规脱蜡，

6、梯度酒精水化，1％h2o2封闭15min,0.01mol/lpbs洗涤,微波抗原修复。2％正常羊血清封闭1h,分别滴加鼠抗人caspase3、caspase9单克隆抗体一抗（均为1∶1000），细胞色素c单抗（1∶500）,4℃孵育过夜,pbs洗涤后滴加hrp标记的二抗(1∶200)室温孵育2h,dab显色15min,苏木素复染。阳性结果判断：免疫组织化学阳性表达为境界清楚，突出背景的棕黄色或棕褐色颗粒，选择5个以上高倍视野，计数不少于500个结肠粘膜细胞中的阳性细胞。用半定量法即肿瘤细胞阳性率与染色

7、强度评分的乘积来表示分别推算整个肿瘤组织中细胞色素c、caspase3与caspase9的表达情况，分别按以下比例记分：肿瘤细胞染色率在0～4％记0分、5%～24％记1分、25％～49％记2分、50％～74％记3分、75％～100％记4分，染色强度用0分（阴性）、1分（弱阳性）、2分（阳性）来表示。具体结果分析按krajeg迅速置于预冷的生理盐水中预处理后放入机械组织匀浆器中，加入裂解液进行匀浆，离心收集上清并加入laemmli样品缓冲液水浴加热、离心，提取总蛋白。每组各取100μg总蛋白样品在sds

8、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转移至nc膜，分别将鼠源性一抗细胞色素c(1∶500)、鼠源性一抗caspase9(1∶1000)和鼠源性一抗caspase3(1∶1000)与膜孵育1h，pbs洗膜。hrp标记羊抗鼠二抗(1∶500)与膜孵育1h。用同样方法标记鼠单克隆抗体βactin作内对照。ecl试剂盒检测蛋白信号。1.8统计学方法用spss11.0统计软件包对数据进行统计学分析。所有数据用±s表示，各均数间比较采用方差