葛根黄酮提取物对hl60细胞增殖和凋亡的影响

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1、葛根黄酮提取物对HL60细胞增殖和凋亡的影响作者：袁怀波，糜漫天，陈宗道，魏兆军【关键词】细胞增殖　　CollegeofBiotechnologyandFoodEngineering,HefEiUniversityofTechnology,HefEI230009,China;DepartmentofNutritionandFoodHygene,3rdMilitaryandMedicalUniversity;CollegeofFoodScience,SouthanleukaemiacancercellsHL60linetorevealitsprobablemechanism

2、.MethodsThesurvivalandproliferationofHL60cellsinedbyMTT.ThecellDNAploidydistributionandapoptoticrateeasuredbyfloetry(FCM),andDNAladder.ThedifferentiationinducedpotenceinedbyNBT.TheanticancerandapoptosispotenceinducedbyflavonoidsdetectedbyTUNEL.ResultsThereorphologicalchangeandDNAladderofa

3、poptosisaineffectingredienthaveanleukaemiacancercellsHL60linethroughinducingapoptosis.　　KeysoniiBentn)的肥大块根，在我国除新疆、青海及西藏外遍布全国各地。葛根中除含有约占新鲜葛根19%~20%的葛根淀粉外，主要成分为异黄酮化合物以及少量黄酮类物质，其中大豆甙元、大豆苷、葛根素是葛根的主要活性成分，尤以葛根素含量最高。近年来研究发现葛根黄酮提取物有抗氧化、抑制癌细胞增殖、诱导黑色素瘤和肝癌细胞凋亡等抗肿瘤作用[13]，但葛根黄酮提取物抗肿瘤的机制及主效成分还未得到揭示。本实

4、验以人白血病HL60细胞为研究对象，研究葛根黄酮提取物抗肿瘤的途径及其抗肿瘤的主效成分，为葛根黄酮提取物开发为抗肿瘤保健食品和药品提供理论依据。　　1材料与方法　　1.1主要试剂与仪器葛根黄酮提取物（野葛），用乙醇提取，经乙醇沉降、AB8大孔树脂柱层析等得到纯度80％的成品，其中含葛根素25.2％、大豆甙元16.2％、三羟基异黄酮21.9％；葛根素、大豆甙元标准品购自中国药品生物制品检定所；RPMI1640为Hyclone公司产品；TUNEL凋亡检测试剂盒为华美生物工程公司产品；INCO2108型CO2培养箱（德国）；流式细胞仪FACS440型（美国）。　　1.2细胞培

5、养实验HL60细胞购于中科院上海细胞生物研究所，培养在RPMI1640培养液中，含10%小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml硫酸链霉素，置于37℃、5%CO2细胞培养箱，常规培养传代。待细胞处于对数生长期时进行实验处理。　　1.3细胞实验分组及药物处理实验设对照组（control）和葛根黄酮提取物、葛根素与大豆甙元处理组。用二甲基亚砜（DMSO）分别将葛根黄酮提取物、葛根素、大豆甙元配成100mg/ml、10-2mol/L、10-2mol/L的储存液，使用液用RPMI1640稀释到所需浓度。DMSO在各组培养液中的浓度均≤0.05％。经预实验确定葛根黄酮提取物、

6、葛根素和大豆甙元的处理浓度分别为50μg/ml、30μmol/L、30μmol/L。　　1.4MTT比色法HL60细胞以1×105个/ml细胞密度接种于96孔培养板中，每孔200μl，加各处理因素，培养1～3d，收获细胞前4h，每孔加入15μlMTT（5mg/ml），37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养4h，去掉培养液，加入200μl异丙醇、二甲基亚砜混合液（1∶1，v/v）。室温30min左右，用酶联仪在492nm处测OD值。　　1.5流式细胞仪检测细胞周期相分布及细胞凋亡率葛根黄酮提取物处理HL60细胞2d，收获细胞，70%冷乙醇固定，RNase消化，碘化丙啶（PI）

7、染色，采用流式细胞仪检测细胞周期相分布和细胞凋亡率。　　1.6DNA梯形带检测经葛根黄酮提取物、葛根素和大豆甙元处理HL60细胞2d后，收获细胞，加入150μlNP40细胞溶破液（1%NP40，20mmol/LEDTA，50mmol/LTris·ClpH7.5）溶破5h，离心收集上清，取上清置于1%SDS溶液中，混匀，加入RNaseA至终浓度为2μg/ml，56℃孵育2h，再加蛋白酶K至终浓度为2μg/ml，37℃水浴2h。加1/2体积的10mol/L醋酸铵和2倍体积的冰冷无水乙醇，于-20℃静置