抵抗素基因转染诱导肝性胰岛素抵抗细胞的鉴定

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　　抵抗素基因转染诱导肝性胰岛素抵抗细胞的鉴定【摘要】目的将编码人抵抗素基因的pcDNA3.1(+)真核表达载体在HepG2肝癌细胞中进行稳定转染，以建立抵抗素诱导的肝性胰岛素抵抗细胞模型。方法实验分3组：HepG2细胞组;空质粒组;抵抗素基因转染组，通过免疫细胞化学和RTPCR方法进行抵抗素基因和蛋白表达鉴定，用微量化的葡萄糖氧化酶法检测细胞对葡萄糖的摄取作用。结果免疫细胞化学染色结果表明：与对照组比较，抵抗素基因转染组抵抗素蛋白平均光密度值显著升高(P<0.01);而空质粒组无显著差异(P>0.05)。RTPCR扩增产物电泳表明：抵抗素基因转染组有目的条带出现，而对照组和空质粒组无目的条带出现，细胞葡萄糖摄取实验表明：抵抗素基因转染细胞对葡萄糖摄取作用下降。结论过度表达人抵抗素基因的胰岛素抵抗的肝细胞建模成功。【关键词】抵抗素;基因转染;HepG2细胞;胰岛素抵抗 2型糖尿病的发病机制主要与胰岛素抵抗有关，抵抗素在啮齿类由脂肪细胞产生并可诱导其产生胰岛素抵抗，而人体内抵抗素主要由单核细胞产生，其诱导人胰岛素抵抗的作用尚无定论。本研究拟通过基因转染技术将编码人抵抗素基因的真核表达载体转染入来源于人的HepG2肝癌细胞形成稳定转染，研究抵抗素诱导人肝细胞性胰岛素抵抗形成的作用，为进一步研究抵抗素诱导胰岛素抵抗的详细分子机制提供科学的研究工具。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1细胞、质粒和抵抗素基因真核表达载体HepG2细胞，pcDNA3.1(+)质粒,pcDNA3.1(+)人抵抗素基因真核表达载体均由吉林大学中日联谊医院中心实验室提供。　　1.1.2主要试剂DMEM高糖培养基(Gibco公司);小牛血清(天津TBD公司);RTPCR试剂盒和引物(上海生工公司);转染试剂盒(Invitrogen公司);抵抗素单克隆抗体(Sigma公司);免疫细胞化学染色试剂盒(福州迈新公司);Trizol(天津TBD公司);G418(北京鼎国生物技术公司)。　　1.1.3主要仪器9700PCR扩增仪(美国PE公司GeneAmpPCRSystem);GIS2008凝胶图像分析系统(上海培清科技公司)，HPIAS1000高清晰度彩色图文分析系统(同济医科大学千屏影像公司);低温高速离心机(日本Hitachi公司)。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养、转染和筛选① 将对数生长期的HepG2细胞在转染前1天接种在24孔板中，使其在转染日生长融合达60%～70%，并换不含双抗的DMEM高糖培养液。②转染当日先把原培养液弃去，用不含血清和双抗的培养液1ml冲洗细胞两次，再每孔加400μl的不含血清和双抗的DMEM高糖培养液。③转染按试剂盒说明书进行:共准备9孔，分成三组：对照组：只加正常培养液;空质粒组：转染未连接抵抗素基因的pcDNA3.1(+)质粒;抵抗素基因转染组：转染连接人抵抗素基因的pcDNA3.1(+)抵抗素基因真核表达载体。④转染后4h吸去转染复合物，每孔加600μl的正常培养液，转染后72h开始加800μg/ml浓度的G418(新霉素)进行筛选，培养。约2RNA①细胞总RNA提取：按Trizol一步法提取总RNA：②引物设计：依据引物设计原则，参照Genbank上抵抗素基因mRNA序列，用Primer5软件进行引物设计。抵抗素上游引物：5′GTAAAGCTCTCTGTCTCCTC3′;下游引物：5′GGAATGCTGCTTATTGCCCT3′，扩增片段长度137bp。内参βactin上游引物：5′CTACAATGAGCTGCGTGTGGC3′;下游引物：5′CAGGTCCAGACGCAGGATGGC3′;扩增片段长度270bp。引物提交上海生物工程技术有限公司合成。③RTPCR反应体系：按试剂盒说明将样品及试剂加入反应管内。④RTPCR反应条件：40℃，30min，94℃，2min;94℃，30s，55℃，45s，72℃，30 s，30个循环，72℃，5min。PCR产物用1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳，用GIS2008凝胶图像分析系统进行分析和拍照。　　1.2.2.2免疫细胞化学染色法鉴定①细胞爬片的制备:在24孔板中放置预先高温高压灭菌的切割好的玻片，然后均匀种植细胞，分三组：对照组，空质粒组，抵抗素基因转染组。每组三个样本,每个样本3复孔。待细胞生长融合达90%时，取出玻片，进行免疫细胞化学染色,同时做阴性对照。②免疫细胞化学染色分析：将制备好的免疫细胞化学染色玻片用HPIAS1000高清晰度彩色图文分析系统进行分析，每张玻片取6个视野，取平均光密度值为免疫细胞化学染色强度定量指标。　　1.2.3抵抗素基因转染对细胞葡萄糖摄取作用的影响应用微量化的葡萄糖氧化酶法，通过检测细胞培养液上清中的残余葡萄糖浓度的改变，由此判断抵抗素对细胞摄取葡萄糖作用的影响;先行噻唑蓝实验(MTT实验)检测抵抗素对细胞生长增殖作用的影响，排除由于细胞增殖引起的细胞数量的差异给实验带来的误差。　　1.2.3.1抵抗素基因转染对HepG2细胞生长增殖作用的影响(MTT实验)分三大组：HepG2细胞组，空质粒组和抵抗素基因转染组，每组又分为：对照组，胰岛素组,每组8个样本。分别将各组细胞均匀接种在96孔板中，细胞密度20 000个/孔。用含10%小牛血清的DMEM高糖培养液培养，待细胞生长至60%融合时，弃去旧培养液，分别加：正常培养液，含胰岛素培养液，每孔200μl。实验中的药物浓度：胰岛素浓度1×10-7mol/L，药物作用48h后。每孔加含5g/L的MTT20μl，在37℃，5%的CO2孵箱中孵育4h，吸去培养液，每孔加入150μlDMSO，混匀后在孵箱中孵育30min后，在490nm处进行吸光度检测。　　1.2.3.2细胞葡萄糖摄取实验分组和培养条件同MTT。药物作用48h后换含10%小牛血清不含酚红的RPMI1640培养液，作用24h后，取培养液上清40μl，再取葡萄糖检测试剂盒中的工作液150μl，混合均匀，在37℃，5%二氧化碳孵箱中孵育15min，取出置酶标仪上在490nm波长处读取吸光度值。　　1.3统计学处理用SPSS13.0软件包进行数据处理，数据以x±s来表示，统计学分析采用t检验。　　2结果　　2.1RTPCR抵抗素基因mRNA表达检测结果见图1，抵抗素基因转染组细胞RTPCR扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，结果在137bp处可见一清晰扩增条带，与目的条带的位置一致，而对照组和空质粒组细胞的RTPCR扩增产物经电泳无目的条带显现。　　2.2抵抗素蛋白免疫细胞化学染色结果 免疫细胞化学染色结果表明，抵抗素基因转染组细胞，胞桨中抵抗素蛋白染色呈棕黄色，而空白质粒组和对照组细胞只出现微弱的黄染。光密度检测结果：对照组：0.1400±0.0079;空质粒组：0.1402±0.0077;抵抗素基因转染组：0.1780±0.0082，抵抗素基因转染组与对照组比较差异显著(P<0.01),而空质粒组和对照组比较无显著差异(P>0.05)，见图2。　　2.3抵抗素基因转染对细胞葡萄糖摄取作用的影响①抵抗素基因转染对细胞增殖作用的影响见表1，胰岛素作用48h后，对正常HepG2细胞组和空质粒组细胞有明显的促进增殖作用，与对照组比较差异显著;而对抵抗素基因转染组细胞无促进增殖作用。②抵抗素基因转染对细胞葡萄糖摄取作用的影响见表2。用完全培养液培养48h后，24h细胞葡萄糖摄取实验结果表明：与对照组比较，空质粒组无显著差异(P>0.05)，而抵抗素基因转染组葡萄糖浓度有显著的增加，差异显著(P<0.01)，表明抵抗素有抑制细胞对葡萄糖的摄取作用。在胰岛素作用下，抵抗素基因转染组与相应的HepG2细胞组比较差异显著(P<0.01)，而空质粒组无显著性差异。表1抵抗素基因转染对HepG2细胞增殖作用的影响与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01表2抵抗素基因转染对细胞葡萄糖摄取作用的影响　　3讨论 　　抵抗素是2001年由Steppan等研究噻唑烷二酮类(TZDs)类药物的药理作用时发现的一种下调基因〔1〕，当时发现应用TZDs类胰岛素增敏剂后，小鼠的血清抵抗素水平下降，同时该肥胖小鼠对胰岛素的敏感性增强，从而认为抵抗素可能是联系肥胖和2型糖尿病的桥梁。目前认为人体中抵抗素主要来源于血液中的单核细胞，由于肝脏不表达抵抗素，血循环中的单核细胞产生的抵抗素(包括脂肪组织中浸润的巨噬细胞产生的抵抗素)将通过血循环作用于肝组织产生作用。动物研究表明抵抗素可诱导肝源性的胰岛素抵抗的发生。在肝脏高表达抵抗素的小鼠模型中，存在肝源性胰岛素抵抗，表现为空腹血糖明显升高，糖耐量减低和高胰岛素血症。高抵抗素使肝脏中胰岛素对腺苷酸激酶(AMPK)的激活作用减弱，胰岛素受体底物2(InsulinReceptorSubstrates2,IRS2)减少及其酪氨酸残基磷酸化水平降低〔2〕，进而使参与糖异生的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖6 磷酸酶表达增加，胰岛素对肝糖异生的抑制作用减弱，最终导致肝糖产生增加，表明小鼠体内抵抗素过度表达对肝性胰岛素抵抗的形成有诱导作用。研究者还用脂肪细胞培养上清提取物和抵抗素作用于HepG2细胞，证实可引起肝细胞性胰岛素抵抗，特别是在加入抵抗素后可以引起强烈的胰岛素抵抗，同时发现曲格列酮干预能够对此进行预防，而脂联素干预没有预防作用，研究者认为这表明抵抗素对人肝源性胰岛素抵抗的形成有着特异性的诱导作用〔3〕。另有在小鼠瞬时转染抵抗素表达载体的实验中也显示〔4〕：抵抗素在小鼠体内的表达，诱导了胰岛β细胞的胰岛素抵抗，使其对葡萄糖刺激的胰岛素分泌反应降低及受损,导致血糖升高。　　肝源性胰岛素抵抗在糖尿病的发病中起着重要的作用。肝脏通过控制糖原合成和分解，控制糖原异生等途径，维持血糖稳定。最初关于抵抗素的研究表明，重组抵抗素在体内可引起正常小鼠的葡萄糖耐量下降，血糖升高。在体外可以阻碍胰岛素刺激的细胞对葡萄糖摄取，去除抵抗素后可使由饮食诱导的肥胖小鼠血糖下降20%，胰岛素的敏感性增强，抗抵抗素的IgG也可以增加胰岛素刺激的细胞对葡萄糖摄取。抵抗素水平升高引起胰岛素抵抗和葡萄糖耐量下降，其机制可能是增加了肝脏的葡萄糖输出〔5〕。　　本研究采用基因转染技术，完成了抵抗素基因真核表达载体在HepG2细胞的稳定转染，用RTPCR方法和免疫细胞化学方法鉴定证实转染成功，抵抗素基因和蛋白质在细胞中表达;细胞摄取葡萄糖实验结果表明抵抗素基因转染导致细胞对葡萄糖的摄取下降，这表明抵抗素过度表达的胰岛素抵抗肝细胞模型建立成功，为进一步研究抵抗素诱导肝源性胰岛素的作用机制提供了科学 的工具和研究手段。【参考