盐酸罗格列酮对糖基化终产物诱导心肌成纤维细胞增殖及分泌no的影响

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1、盐酸罗格列酮对糖基化终产物诱导心肌成纤维细胞增殖及分泌NO的影响【摘要】目的：探讨盐酸罗格列酮对糖基化终产物（AGEs）诱导新生大鼠心肌成纤维细胞（CFs）增殖及分泌一氧化氮（NO）的影响。方法：采用胰酶消化法和差速贴壁分离法获取CFs，应用MTT法、流式细胞术（FCM）分别观察不同浓度盐酸罗格列酮对AGEs作用下CFs的细胞增殖、细胞周期的影响；硝酸还原酶法分别测定不同条件下CFs培养液中的NO水平。结果：AGEs对CFs的增殖有显著的促进作用；不同浓度的盐酸罗格列酮干预后，与AGEs组对比A值均明显

2、下降（P<0.05）；S期及G2/M期细胞百分值明显低于AGEs组，而G0/G1期的细胞百分值增高（P<0.05），且随着浓度的增加，抑制细胞增殖作用越显著。AGEs抑制CFs分泌NO，盐酸罗格列酮可阻断AGEs的上述作用，并呈一定的浓度依赖关系（P<0.01）。结论：在一定浓度范围内，盐酸罗格列酮呈剂量依赖性地抑制AGEs诱导的大鼠CFs增殖，并阻断AGEs抑制CFs分泌NO。【关键词】盐酸罗格列酮;糖基化终产物;心肌成纤维细胞;一氧化氮糖基化终产物(advancedglycosyl

3、ationendproducts，AGEs)在体内积聚是导致糖尿病慢性并发症发生发展的重要原因之一[1]。糖尿病心肌病变是糖尿病的主要并发症之一。近年来已认识到心肌成纤维细胞（CFs）和心肌间质在心肌重构中起着不可忽视的作用，研究发现，CFs具有分泌多种生物活性物质的能力[2]。近来大量资料提示内皮素、一氧化氮(nitricoxide，NO)等一些生物活性物质与心肌纤维化的发生、发展密切相关[3]。噻唑烷二酮类(TZDs)降糖药对AGEs诱导CFs增殖及分泌NO的影响未见报道。　　1材料与方法　　1.1

4、材料SD大鼠乳鼠由南京军区总院实验动物中心提供,胎牛血清(杭州四季青生物技术材料研究所)、DMEM干粉培养基(Gibco公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、四氮唑蓝(MTT，Gibco公司)均购于南京创瑞生物技术有限公司，NO含量测定试剂盒购于南京建成生物公司，AGEs由东南大学医学院心血管病研究所提供，盐酸罗格列酮（维戈洛）由上海三维制药公司惠赠。　　1.2CFs的分离、培养和鉴定无菌条件下取下新生1～4ｄ龄SD大鼠乳鼠(雌雄不限)心室，浸入DHanks液中剪碎，用0.06%胰蛋白酶于37℃水浴并在

5、磁力搅拌器上(速率100r·min-1)分次消化成单细胞悬液。此时细胞悬液的主要成分是搏动的心肌细胞及CFs，利用CFs能更快更早贴壁的特点将两种细胞分离。经两次差速贴壁后，首次先贴壁的为成纤维细胞，用含体积分数为0.1的胎牛血清的DMEM培养液培养至融合状态时进行传代，第2代细胞按每毫升5×104个细胞数量均匀接种培养。使用倒置显微镜观察两种细胞的形态，用血细胞计数板和台盼蓝染色进行活细胞计数。经倒置显微镜、透射电镜确认，SABC免疫组化染色示纤维粘连蛋白染色阳性，血管平滑肌肌动蛋白Ⅷ因子和结蛋白染色

6、阴性，证实所培养的细胞为CFs，实验采用2～4代细胞。1.3实验分组实验中将2~4代CFs分为空白对照、AGEs（100mg·L-1）、AGEs加盐酸罗格列酮0.1mmol·L-1、AGEs加盐酸罗格列酮1.0mmol·L-1和AGEs加盐酸罗格列酮10.0mmol·L-15组。　　1.4MTT法检测细胞数取对数生长的CFs，2.5g·L-1胰酶消化，用含10％胎牛血清的DMEM调节细胞密度为2.5×107L-1，加入96孔培养板中接种，每孔200μl，静置培养至细胞贴壁、伸展，分别加入100mg·L-

7、1AGEs及不同浓度盐酸罗格列酮培养48h后，每孔加入10μlMTT溶液(5g·L-1)，37℃继续培养4ｈ小心吸弃培养液上清，每孔加入二甲基亚砜150μl，振荡混匀10min，测490nmＡ值。　　1.5细胞周期测定细胞经传代并加入不同试剂培养24ｈ后，将单层培养细胞(对数生长期)用胰酶消化。加入3～4ml无钙、镁离子的PBS液，用吸管反复操作使成为单个细胞悬液，调细胞密度为1×109L-1，离心，去上清，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。使用细滴管将细胞迅速注入4℃70％冷乙醇中，4℃保存

8、。调整细胞密度为1×109L-1，碘化丙锭染色15min后用FACS440型流式细胞仪（BectonDickinson，美国）进行细胞周期分析，计算机处理后得出各期细胞数目及其占总细胞数的百分比。　　1.6NO含量测定NO在体外转化为NO-2和NO-3，利用硝酸还原酶将NO-3还原为NO-2，通过显色深浅测定NO-2浓度来推算NO含量。操作按试剂盒说明进行，NO含量以公式（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×100