当归注射液对免疫诱导再障小鼠骨髓微环境及il

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1、当归注射液对免疫诱导再障小鼠骨髓微环境及IL【关键词】再生障碍性贫血　　再生障碍性贫血(aplasticanemia,AA)是血液系统常见疾病，传统的治疗方法效果欠佳，临床死亡率高。因此，对AA发病机制的研究以及寻找有效的治疗药物具有重要的理论和实践意义。目前对于AA，国内多采用中西医结合治疗。当归是著名常用中药，具有养血活血作用［1］，过去多用于治疗腰腿痛和妇科疾病，随着临床研究的进展，其应用范围逐渐扩大。作为补血中药，其在血液系统疾病中的应用及研究也日渐增多。至目前为止，有关当归在血液系统的药理作用

2、基本归纳为：①抑制血小板聚集及抗血栓形成；②刺激骨髓造血；③促进免疫功能恢复；④抗辐射损伤等。武汉大学人民医院儿科从1991年起将当归注射液用于临床治疗AA，取得较好的疗效［2］。但该药治疗AA的实验研究却少有报道。本实验用当归注射液对免疫诱导AA小鼠进行干预治疗，观察其对AA小鼠体重、外周血白细胞计数、骨髓单个核细胞计数、骨髓微环境等的影响，并从分子水平研究其作用机制，进一步为临床应用该药治疗AA提供实验依据。1材料与方法11材料111动物雌性Balb/c小鼠(H2a、MLSb)8~12周龄，17~2

3、0g，由武汉生物制品研究所提供。DBA/2小鼠(H2a、MLSa)8~10周龄，雌雄不拘，由上海斯莱克实验动物有限公司提供。112药品、试剂及来源25%当归注射液由武汉大学中南医院药剂科提供，批号：0303131，每毫升含当归生药0.25g。大鼠抗小鼠CD49dRPE单克隆抗体、CD49eFITC单克隆抗体、羊抗大鼠IgGFITC荧光抗体、大鼠抗小鼠细胞周期蛋白D2单克隆抗体、溴化丙啶(PI)、RnaseA、Triton100均购自深圳晶美公司。Ficoll干粉、人淋巴细胞分离液购自美国Sigma公司。

4、113试剂配制(1)0.01mol/L磷酸生理盐水(phosphatebuffersaline,PBS)的配制：磷酸氢二钠(Na2HPO4)：3.48g；氯化钾(KCl)：0.2g；磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.2g；氯化钠(NaCl)：8.0g。加入1L双蒸水稀释后滤纸过滤，消毒，4℃冰箱保存待用。(2)小鼠淋巴细胞分离液的配制：Ficoll干粉2.1g加入20ml双蒸水，配成10.5%溶液，过滤待用，用人淋巴细胞分离液100ml加入配制好的10.5%Ficoll溶液7ml，配成小鼠淋巴细胞分离液。

5、过滤消毒，4℃冰箱避光保存待用。(3)台盼蓝的配制：4%台盼蓝母液：取4g台盼蓝溶入100mlPBS中，过滤消毒，4℃冰箱保存待用。工作浓度为0.4%。114主要仪器(1)AIRTECH超净工作台：江苏安泰空气净化技术公司生产；(2)网格测微器：购自上海森雄公司；(3)博赛酶标仪。12动物模型的制备与分组121免疫诱导再生障碍性贫血小鼠模型的建立参照姚军等［3］方法，取DBA/2小鼠，断颈处死，常规75%酒精消毒，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟、肠系膜等处淋巴结，加少量生理盐水，轻轻磨碎，过滤后

6、用1ml注射器抽取，并将此液沿管壁缓慢加入装有配制好的小鼠淋巴细胞分离液的试管中，置水平离心机离心，转速2000转/分，20分钟后取出，可见淋巴细胞悬液在中间层，用无菌吸管将淋巴细胞悬液吸出后，用PBS冲洗二遍，离心机离心，1500转/分，5分钟，弃上清，配成单细胞悬液，台盼蓝鉴定细胞活性，活性细胞达98%。计数后配成所需浓度备用。雌性Balb/c小鼠，经60Co6Gyγ-射线亚致死量全身照射(空气量7.39Gy，距离80cm，时间6.87min)。4小时内由尾静脉输入取自DBA/2小鼠胸腺、淋巴结混合

7、细胞，细胞量为每只1×106/0.2ml。122分组与处理制模后小鼠分为4组，分别为模型对照组、当归注射液小剂量组、当归注射液大剂量组、丙酸睾丸酮组，每组8只，另设8只同批正常未经任何处理Balb/c小鼠为正常对照组。①正常对照组：予无菌生理盐水10ml/kg.d腹腔注射，连续12天。②模型对照组：于制模当天腹腔注射无菌生理盐水10ml/kg.d，连续12天。③、④当归注射液小剂量组、当归注射液大剂量组：分别于制模当天给予当归注射液注射液2ml/kg.d及10ml/kg.d腹腔注射。⑤丙酸睾丸酮组：于制

8、模当天腹腔注射丙酸睾丸酮10mg/kg.d。所有小鼠均给予每升含红霉素250mg及庆大霉素320万U的无菌水喂养。13检测的指标及方法131体重变化、外周血白细胞和骨髓单个核细胞计数于制模第12天小鼠称重后，经尾静脉采血，按常规方法行外周血白细胞计数后，断颈处死，取右侧股骨，用PBS冲出骨髓细胞，计数，即为1根股骨中的骨髓单个核细胞(mononucleatecells,MNC)。132尺骨骨髓切片组织学观察取尺骨固定，塑料包埋切片，HGE染