弓形虫“迟发型死亡”机制的研究

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1、摘要摘要目的：弓形虫病是一种在世界范围内广泛流行的人兽共患病寄生虫病，可以造成孕妇流产和胎儿畸型，并且是引起免疫功能缺陷患者死亡的重要病原体之一。现有的抗弓形虫药物都存在副作用大、停药后易复发等不足，目前临床仍缺乏有效的治疗药物。顶质体缺乏引起的“迟发型死亡"为弓形虫病治疗提供了一条新途径，但其确切机制仍不完全清楚，难以应用于临床治疗。因此，开展“迟发型死亡”机制研究对弓形虫病的防治具有重要意义。方法：收集体外培养的弓形虫RH株速殖子并提取其RNA，RT-PCR法分别扩增酰基载体蛋白(ACP)和p．酮脂酰ACP合成酶(FABZ)编码基

2、因，构建原核表达载体acp／pET28和fabz／pET32，并在大肠杆菌rostta株表达。重组ACP和FABZ蛋白经Ni．NTA亲合纯化柱纯化，并免疫家兔制备多克隆抗体。以兔多克隆抗体Westernblotting法检测虫体ACP和FABZ表达。收集体外培养的弓形虫hxgprt株速殖子并提取其DNA，PCR法扩增ACP蛋白基因，构建弓形虫转染载体pHX．ACP．GFP，电穿孔法导入hxgprf株速殖子，霉酚酸和黄嘌呤筛选ACP—GFP突变株。激光共聚焦显微镜观察ACP．GFP融合蛋白在虫体的分布，以兔抗GFP多克隆抗体Wester

3、nblotting法检测ACP—GFP蛋白的表达。人包皮成纤维(mF)细胞中接种弓形虫ACP．GFP突变株5×105个，24h后在培养液中添加终浓度1mM克林霉素诱导“迟发型死亡”，于2h、4h和6h收集虫体。Real．timePCR法检测虫体ACP和GRAl蛋白编码江苏大学博士论文：弓形虫“迟发型死亡”机制的研究mRNA表达，Westernblotting法检测ACP和GRAl蛋白表达，激光共聚焦显微镜观察ACP．GFP融合蛋白在虫体内分布。收集体外培养TATi株速殖子并提取DNA，PCR法扩增FABZ蛋白基因，构建含有Ty标签的可

4、诱导敲除载体pTet07-Sagl—FABZ—Ty—DHFR，电穿孔法导入TATi株，1}tg／ml乙胺嘧啶筛选可诱导敲除突变株，以Ty单克隆抗体Westernblotting法检测突变株FABZ—Ty融合蛋白表达。将该突变株接种HFF细胞，加入1gg／ml脱水四环素(ATc)启动可诱导敲除系统，于24h和48h时收集虫体，Westernblotting法检测虫体FABZ．Ty融合蛋白表达量。mF细胞中接种四环素可诱导敲除突变株5x105个，同时加入1l上g／mlATe启动可诱导敲除系统。分别于感染后2h、4h、8h、12h、24h和

5、48h收集虫体，Real．timePCR法检测不同时间FABZ蛋白编码mRNA表达量以及虫体uprt基因拷贝数，Giemsa染色法观察不同时间HFF细胞内速殖子／纳虫泡数量。结果：弓形虫cDNA中分别扩增出约550bp和700bp的ACP和FABZ蛋白编码基因。PCR、限制性内切酶酶切和基因测序鉴定结果表明载体acp／pET28和fabz／pET32构建成功。转化大肠杆菌rostra株并成功表达重组ACP和FABZ蛋白，经Ni—NTA亲合纯化柱纯化获得纯度较高的重组蛋白。制备的多克隆抗体可以分别检测出虫体ACP和FABZ蛋白的转运肽型

6、及成熟型。弓形虫基因组DNA中扩增出约1300bp的acp基因。PCR、限制性内切酶酶切和基因测序鉴定结果表明载体pHX．ACP—GFP构建成功，可以用于虫体转染。虫体经1次电击后仍有大量存活并可迅速进入HeLa细胞，霉酚酸和黄嘌呤2"--3天即可杀死未转染虫体。激光共聚焦显微镜观Il摘要察到绿色荧光呈点状聚集于项质体，部分绿色荧光弥散地分布于虫体内质网。兔抗GFP多克隆抗体Westernblotting法可以识别出虫体ACP蛋白的转运肽型(t-ACP)和成熟型(m—ACP)。1州克林霉素作用2h和4h，虫体ACP蛋白编码mRNA表达

7、量较对照组无显著性差异；作用6h，ACP蛋白编码mRNA表达量较对照组显著降低。Westernblotting结果表明，克林霉素作用2h，虫体t-ACP和m—ACP表达量与对照组无明显差异；作用4h，虫体rn．ACP表达量较对照组显著降低，而t-ACP表达量无明显变化；作用6h后，虫体t-ACP和m．ACP表达量均明显降低。激光共聚焦显微镜观察到克林霉素作用2h，虫体内同时存在着点状绿色荧光和弥散成片的绿色荧光；作用4h，点状绿色荧光逐渐减少，弥散的绿色荧光变化不明显；作用6h，点状绿色荧光基本消失，弥散的绿色荧光较2h和4h明显减弱

8、。TATi株虫体基因组DNA中扩增出约800bp产物。PCR法、限制性内切酶酶切法和基因测序法鉴定pTet07．Sagl。FABZ。Ty．DHFR载体构建成功。1Itg／ml乙胺嘧啶2～3天即可杀死未转染虫体。Ty标签单