活血止痛贴微生物限度检查方法验证

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1、活血止痛贴微生物限度检查方法验证王俊贵州省食品药品检验所，贵州贵阳550004【摘要】目的：建立活血止痛贴微生物限度检查方法。方法：按照2010版《中国药典》一部的微生物限度检查法，采用常规平皿法和平皿稀释法对各试验菌的回收率逐一进行验证；采用常规法和稀释法进行控制菌铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的方法验证。结果：大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌采用平皿稀释法时，回收率均高于70%；白色念珠菌、黑曲霉采用常规平皿法时回收率均高于70%，采用稀释法检查控制菌铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌时实验组检出实验菌。结论：活血止痛贴细菌计数采用平皿稀释法检查，霉菌和酵母菌计数采

2、用常规平皿法检查，控制菌铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌采用稀释法检查，方法经验证有效，可用于此药品的微生物限度检查，能有效控制药品质量，准确可靠。.jyqkonasaeruginosa）［CMCC（B）10104］第3代。2方法与结果2.1菌液制备方法接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，置30～35℃培养18～24h，分别取上述培养物1ml，加0.9%的无菌氯化钠溶液9ml，10倍递增稀释制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，置23～28℃培养24～48h，取培养

3、物1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，10倍递增稀释制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液；接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，置23～28℃培养5～7d，加入5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。吸出孢子悬液至无菌试管内。取原液1ml，加含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml，10倍递增稀释制成每1ml含孢子数为50～100cfu的孢子悬液。2.2供试液制备按2010年版《中国药典》一部附录微生物限度检查法之规定，取供试品100cm2，放置于无菌纸上，粘贴面朝上，用无菌

4、纱布覆盖贴膏剂的粘贴面，然后用无菌剪刀剪碎，置500ml无菌的含玻璃珠的三角瓶中，加30ml的十四烷基酸异丙酯，45℃保温振摇至供试品分散均匀，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至200ml，充分振摇，将部分油脂倒出，将剩余萃取液倒入无菌的分液漏斗中待油水明显分层，萃取，用三角烧瓶收集水层作为1∶20供试液，备用。2.3菌落计数方法的验证2.3.1试验组取1∶20供试液分1、0.5、0.2ml和含50~100cfu的试验菌液（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉），分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌

5、）和玫瑰红钠琼脂培养基（白色念珠菌和黑曲霉），每株试验菌平行制备2个平皿，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌置30～35℃培养3d，白色念珠菌和黑曲霉置23～28℃培养5d，测定其菌数。2.3.2菌液组分别吸取含50~100cfu的试验菌液（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉），注入灭菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基（大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）和玫瑰红钠琼脂培养基（白色念珠菌和黑曲霉）每株试验菌平行制备2个平皿，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌置30～35℃培养3d，白色念珠菌和黑曲霉置23～28℃培养5d，测定其

6、菌数。2.3.3供试品对照组取1∶20供试液分1、0.5、0.2ml分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，细菌计数和霉菌及酵母菌计数分别平行制备2个平皿，营养琼脂培养基置30～35℃培养3d，玫瑰红钠琼脂培养基置23～28℃培养5d，测定其菌数。2.3.4回收率计算各试验菌株的回收率=（实验组平均菌落数－供试品对照组平均菌落数）÷菌液组平均菌落数×100%，结果见表1-3。由表1、表2、表3的结果可知，平皿稀释法试验大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌3株菌株回收率均能达到70%以上，常规平皿法试验白色念珠菌、黑曲霉2株菌株回收率均能达到70%

7、以上，说明平皿稀释法法可用于活血止痛贴的细菌计数，常规平皿法可用于活血止痛贴的霉菌及酵母菌计数。2.4控制菌检查方法的验证2.4.1金黄色葡萄球菌检查方法的验证2.4.1.1试验组分别取1∶20的供试液各20ml及含50~100cfu金黄色葡萄球菌菌液，分别接种至100、200ml的营养肉汤培养基内，34℃培养24h，可见100ml培养基不混浊，200ml培养基混浊，取上述两种培养物，划线接种至甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24h，可见100ml的无菌生长，200ml的有菌落生长，呈金黄色，圆形凸起，边缘整齐，光滑湿润，外周有黄色环