含风疹病毒部分核酸序列噬菌体样颗粒研制及其应用是研究

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1、由东大学博士学位论文含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒的研制及其应用研究博士研究生：赵立红导师：王志玉教授专业：病原生物学中文摘要风疹瘸毒是常觅鹣上呼吸道感染病原体，也是常见的胎踅致畸酶主要病原之一。风疹病毒主要侵犯上呼吸道粘膜，引起上呼吸道炎症。风疹病毒感染最严重的问题是孕妇感染可导致对婴儿的先天性损害，尤其前3个月感染风疹病毒，可通过胎盘感染胎，毛，导致孕妇流产、死胎，或新生尼一系列的器官畸形等先天性风疹综合症。目前，风疹病毒实验室诊断越来越多地采用核酸扩增方法来检测临床标本中的风疹病毒RNA。僵是，目前使用的以RT-P

2、CR为主的RNA病毒核酸扩增检测试剂盒中，一般采用风疹病毒颗粒、裸露RNA或病毒RNA逆转录的eDNA作为阳性质控品或标准品。病毒颗粒和裸露RNA具有潜在的生物传染性，不稳定，易被RNase降解；eDNA不在病毒颗粒内，无法模拟临床标本中病毒核酸的提取及RNA逆转录过程，所以，风疹病毒颗粒、裸露RNA或病毒RNA逆转录的eDNA作为标准品或质控品，准确性都不理想。因砥，人们普遍关心的是病毒核酸检测试剂盒中使用的阳性参考晶和质控品是否具有传染性以及能否起到阳性全程监控的作用。提逝假设：利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性，采用

3、原核表达技术将风疹病毒El部分保守序列包装至UMS2噬菌体衣壳蛋自内构成噬藏体样颗粒，组装成内含风疹病毒El部分保守序列耐RNase的噬菌体样颗粒，并将其作力阳性标准晶应用于风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法中，并对其进行评价。实验目的：1．建立风疹病毒RNATaqmMan实时荧光定量RT-PCR方法。2．利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性，采用原核表达技术将风疹病毒El部分保守序列包装到MS2噬菌体衣壳蛋白内构成噬菌体样颗粒，组装成内含风疹病毒El部分保守序列耐RNase的噬菌体样颗粒。山东大学博士学

4、位论文3．将构建的风疹病毒RNA噬菌体样颗粒作为阳性标准品，应用于所建立的风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT—PCR方法中，并对其进行评价。实验第一部分：建立风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法，将风疹病毒RNA逆转录cDNA作为RV实时荧光定量RT—PCR阳性标准品，定量检测已确诊的风疹患者咽拭子标本中风疹病毒RNA，评价其敏感度与特异度。实验第二部分：利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性，采用原核表达技术将风疹病毒El部分保守序列包装至[JMS2噬菌体衣壳蛋白内构成噬菌体样颗粒。即将大肠杆菌MS

5、2噬菌体衣壳蛋白的编码基因序列构建到原核表达载体pET30a(+)获一重组表达载体，然后将风疹病毒E1的部分高度保守RNA序列构建到该重组表达载体上，经诱导后表达获内含风疹病毒E1部分保守序列的噬菌体样颗粒，然后对内含风疹病毒El部分保守序列的噬菌体样颗粒进行定量分析，并验证其耐核糖核酸酶(RNase)特性，以及分析其在4℃和37℃血浆中的稳定性，并与风疹病毒病毒株在37"C血浆中的稳定性进行比较。实验第三部分：将实验第二部分构建的内含风疹病毒E1部分保守序列的噬菌体样颗粒作为阳性标准品应用于实验第一部分所建立的风疹病毒RNA

6、TaqMan实时荧光定量RT-PCR方法中，并定量检测已确诊的风疹患者鼻咽拭子标本中风疹病毒RNA，评价其敏感度与特异度。通过对其检测灵敏度、重复性、敏感度与特异度等指标的测定，并与实验第一部分中RNA逆转录cDNA作为阳性标准品时的相应指标进行比较，来分析实验第二部分构建的内含风疹病毒E1部分保守序列的噬菌体样颗粒作为阳性标准品的优势所在。实验方法：1．建立风疹病毒RNATaqMan实时荧光定量RT-PCR方法，将风疹病毒RNA逆转录的cDNA，作为RV实时荧光定量RT-PCR阳性标准品，定量检测已确诊的风疹患者鼻咽拭子标本

7、中风疹病毒RNA，评价其敏感度与特异度。2．利用MS2噬菌体衣壳蛋白自我组装的特性，采用原核表达技术将风疹病毒E1部分保守序列包装NMS2噬菌体衣壳蛋白内构成噬菌体样颗粒，采用基因工程方法2山东大学博士学位论文构建含部分RVE1、MS2衣壳蛋白及装配蛋白编码基因重组表达载体，经IPTG诱导表达获得含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒。3．行RT-PCR及PCR对噬菌体样颗粒包绕的内容物风疹病毒RNA进行验证。4．采用风疹病毒实时荧光定量RT-PCR方法对含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒进行定量分析。5．将噬菌体样颗粒悬浮液

8、用TSM稀释液分别稀释107、108、109倍，对含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒每一个浓度实施RNase处理，采用实时荧光定量RT—PCR方法定量检测RNase处理前后的含风疹病毒部分核酸序列的噬菌体样颗粒，通过比较RNase处理前后的Ct值有没有显著性差别，来验证含风